小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备成骨细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备成骨细胞的方法。所述小分子化合物组合包括按时序分阶段使用的第一阶段小分子化合物和第二阶段小分子化合物，所述第一阶段小分子化合物包括TGF‑β受体抑制剂，WNT/β‑catenin激动剂和cAMP激动剂；所述第二阶段小分子化合物包括赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂，TGF‑β受体抑制剂，PKC抑制剂，WNT/β‑catenin激动剂和cAMP激动剂。本发明专利技术通过小分子化合物分阶段诱导，能够将分化的细胞转分化为成骨细胞，各步骤可实现精准质控，便于标准化操作和规模化生产。本发明专利技术提供的方法供体来源广泛，患者本人即可作为供体，可在较短时间内获得基础研究、临床治疗或组织工程生产所需的成骨细胞。

【技术实现步骤摘要】
小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备成骨细胞的方法
本专利技术涉及细胞生物学，组织工程和再生医学领域，尤其涉及一种小分子化合物组合及利用该小分子化合物组合诱导分化的细胞制备成骨细胞的方法。
技术介绍
：现有的骨组织工程或再生医学成骨种子细胞包括分化晚期的成骨细胞、成骨细胞株、骨髓混合细胞或纯化的间充质干细胞。但此类细胞的存在来源有限、获取过程复杂并伴随供体较重的伤害等问题，因而应用受限。多种分化的细胞如皮肤成纤维细胞具有来源丰富、易于获取并易于在体外长期大量扩增培养的优点。目前利用细胞转分化技术已经可以把分化的细胞如皮肤成纤维细胞直接诱导为成肌细胞、神经元、肝细胞、成骨细胞等多种不同类型的功能细胞；或先诱导为多能干细胞后，再进一步定向诱导为相应的功能细胞。上述采用细胞转分化技术从某种特定分化的细胞如皮肤成纤维细胞直接或间接诱导获得的功能细胞已经不再保持源细胞的分子特征与功能，但获得了相应目标细胞的典型分子特征与细胞功能。目前，上述诱导性功能细胞已逐渐应用于疾病模型研究、临床治疗研究与组织工程研究。传统的细胞转分化需要通过导入特定的外源性基因实现，有时还需要相应的小分子化合物、细胞因子或重组蛋白协同作用。文献已有较多采用特定外源性基因把某一分化的细胞诱导为另一功能性分化的细胞的报道。如文献已有采用BMP-2，BMP-7，LMP3单独或协同作用使皮肤成纤维细胞转分化为在体外、体内都具有骨形成作用的成骨细胞的报道。但导入外源性基因存在致瘤风险，并可能使目标细胞产生免疫原性，难以推广应用。2013年，邓宏魁报道仅采用小分子化合物或其组合可以实现鼠皮肤成纤维细胞重编程为神经细胞的转分化过程，并证实该细胞转分化技术具有诱导过程短、诱导系统稳定、易于质控、成本低、无外源性基因插入导致的致瘤风险、获得的目标细胞具有良好的安全性与稳定性且无免疫原性，具有潜在的临床应用价值与产业化前景。此后，申请号为201410075246.5的中国专利申请提供了一种把分化的细胞诱导转分化为神经干细胞的方法及其应用。具体地，该申请涉及采用组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂、糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂和转化生长因子β(TGF-β)信号通路抑制剂的组合，在正常生理低氧环境下诱导成纤维细胞、上皮细胞等分化的细胞转分化为具有良好多能性及传代稳定性的神经干细胞。申请号为201610213644.8的中国专利申请提供了一种诱导成纤维细胞转分化为心肌细胞的诱导培养基、方法及其应用，所述诱导培养基包含基础培养基和诱导小分子组合，所述诱导小分子组合为6TCFOW或SCFOV，其中6为E61541、T为苯环丙胺、C为CHIR99021、F为毛喉素、O为Dorsomorphin、W为IWR-1、S为SB431542、V为丙戊酸。该申请诱导培养基能够将成纤维细胞诱导转分化为心肌细胞。目前，通过采用单纯小分子化合物或其组合诱导人类分化的细胞如皮肤成纤维细胞获得施旺细胞(THOMAEC，etal，2014)、神经细胞(HUW，etal，2015)、胰岛细胞(ShengDing，etal，2015)的成果已陆续见诸报道。由于人类与小鼠存在约25％的基因差异，而将上述在小鼠细胞实验中获得成功的专利申请技术方案应用于人的同类细胞转分化可行性不高；另一方面，由于诱导同类细胞转分化获得不同目标细胞的具体理论基础与技术手段并不相同，申请人采用上述报道的技术方案分别重复试验，既未能把应用于小鼠细胞的转分化技术方案成功应用于人的同类细胞转分化，也未能把人类分化的细胞诱导转分化为成骨细胞。
技术实现思路
本专利技术提供了一种小分子化合物组合及利用小分子化合物组合诱导制备成骨细胞的方法。本专利技术通过利用小分子化合物组合按时序分阶段处理分化的细胞快速稳定程序化地获得大量成骨细胞或其产物。本分明第一方面，提供一种小分子化合物组合，所述小分子化合物组合包括按时序分阶段使用的第一阶段小分子化合物和第二阶段小分子化合物，所述第一阶段小分子化合物包括TGF-β受体抑制剂，WNT/β-catenin激动剂和cAMP激动剂；所述第二阶段小分子化合物包括赖氨酸脱乙酰基酶(Lysinedeacetylasesinhibitors，KDACIs)抑制剂，TGF-β受体抑制剂，PKC抑制剂，WNT/β-catenin激动剂和cAMP激动剂。进一步地，所述第一阶段小分子化合物还包括赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂，所述第二阶段小分子化合物还包括RAR激动剂，DNMT抑制剂，HMT抑制剂，ascorbate(抗坏血酸)，JNK抑制剂，ROCK抑制剂和组蛋白去甲基化酶抑制剂中的至少一种。作为优选，所述赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂为sodiumphenylbutyrate，butyrate，sodiumbutyrate，MC1568，CI994(Tacedinaline)，chidamide，CAY10683(SantacruzaMateA)，CUDC-907，M344(HistoneDeacetylaseInhibitorIII)，LAQ824(NVP-LAQ824，Dacinostat)，Pracinostat(SB939)，VPA，Scriptaid，Apicidin，LBH-589(Panobinostat)，MS-275，SAHA(Vorinostat)，Trichostatin(TSA)，PsammaplinA，PCI-24781(Abexinostat)，Rocilinostat(ACY-1215)，Mocetinostat(MGCD0103)，4-Phenylbutyrate(4PB)，splitomicin，SRT1720，resveratrol，Sirtinol，APHA，CI-994，Depudecin，FK-228，HC-Toxin，ITF-2357(Givinostat)，Chidamide，RGFP966，PHOB，BG45，NexturastatA，TMP269，CAY10603，MGCD-0103，Niltubacin，PXD-101(Belinostat)，Pyroxamide，Tubacin，EX-527，BATCP，Cambinol，MOCPAC，PTACH，MC1568，NCH51和TC-H106中的至少一种；所述TGF-β受体抑制剂为616452，LY2109761，Pirfenidone，Repsox(E-616452)，SB431542，A77-01，Tranilast，Galunisertib(LY2157299)，A8301，GW788388，ITD-1，SD208，SB525334，LY364947，ASP3029，D4476和SB505124中的至少一种；所述PKC抑制剂为Go6983，Ro31-8220Mesylate，Go6976和BisindolylmaleimideI(GF109203X)的至少一种；所述WNT/β-catenin激动剂为MAY-262611，CHIR98014，CHIR99021，LiCl，Li2CO3，TD114-2，AZD2858，AZD1080，BIO，Kenpaullone，TWS119，LY2090314，CB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小分子化合物组合，其特征在于，所述小分子化合物组合包括按时序分阶段使用的第一阶段小分子化合物和第二阶段小分子化合物，所述第一阶段小分子化合物包括TGF‑β受体抑制剂，WNT/β‑catenin激动剂和cAMP激动剂；所述第二阶段小分子化合物包括赖氨酸脱乙酰基酶(Lysine deacetylases inhibitors，KDACIs)抑制剂，TGF‑β受体抑制剂，PKC抑制剂，WNT/β‑catenin激动剂和cAMP激动剂。

【技术特征摘要】
1.一种小分子化合物组合，其特征在于，所述小分子化合物组合包括按时序分阶段使用的第一阶段小分子化合物和第二阶段小分子化合物，所述第一阶段小分子化合物包括TGF-β受体抑制剂，WNT/β-catenin激动剂和cAMP激动剂；所述第二阶段小分子化合物包括赖氨酸脱乙酰基酶(Lysinedeacetylasesinhibitors，KDACIs)抑制剂，TGF-β受体抑制剂，PKC抑制剂，WNT/β-catenin激动剂和cAMP激动剂。2.如权利要求1所述的小分子化合物组合，其特征在于，所述第一阶段小分子化合物还包括赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂，所述第二阶段小分子化合物还包括RAR激动剂，DNMT抑制剂，HMT抑制剂，ascorbate(抗坏血酸)，JNK抑制剂，ROCK抑制剂和组蛋白去甲基化酶抑制剂中的至少一种。3.如权利要求2所述的小分子化合物组合，其特征在于，所述赖氨酸脱乙酰基酶抑制剂为sodiumphenylbutyrate，butyrate，sodiumbutyrate，MC1568，CI994(Tacedinaline)，chidamide，CAY10683(SantacruzaMateA)，CUDC-907，M344(HistoneDeacetylaseInhibitorIII)，LAQ824(NVP-LAQ824，Dacinostat)，Pracinostat(SB939)，VPA，Scriptaid，Apicidin，LBH-589(Panobinostat)，MS-275，SAHA(Vorinostat)，Trichostatin(TSA)，PsammaplinA，PCI-24781(Abexinostat)，Rocilinostat(ACY-1215)，Mocetinostat(MGCD0103)，4-Phenylbutyrate(4PB)，splitomicin，SRT1720，resveratrol，Sirtinol，APHA，CI-994，Depudecin，FK-228，HC-Toxin，ITF-2357(Givinostat)，Chidamide，RGFP966，PHOB，BG45，NexturastatA，TMP269，CAY10603，MGCD-0103，Niltubacin，PXD-101(Belinostat)，Pyroxamide，Tubacin，EX-527，BATCP，Cambinol，MOCPAC，PTACH，MC1568，NCH51和TC-H106中的至少一种；所述TGF-β受体抑制剂为616452，LY2109761，Pirfenidone，Repsox(E-616452)，SB431542，A77-01，Tranilast，Galunisertib(LY2157299)，A8301，GW788388，ITD-1，SD208，SB525334，LY364947，ASP3029，D4476和SB505124中的至少一种；所述PKC抑制剂为Go6983，Ro31-8220Mesylate，Go6976和BisindolylmaleimideI(GF109203X)的至少一种；所述WNT/β-catenin激动剂为MAY-262611，CHIR98014，CHIR99021，LiCl，Li2CO3，TD114-2，AZD2858，AZD1080，BIO，Kenpaullone，TWS119，LY2090314，CBM1078，SB216763和AR-A014418中的至少一种；所述cAMP激动剂为EPAC/RAP1激动剂，8-Bromo-cAMP，Dibutyryl-Camp和Sp-8-Br-cAMPs中的至少一种；所述EPAC/RAP1激动剂为Forskolin，IBMX，ProstaglandinE2(PGE2)，NKH477，8-pCPT-2′-O-Me-cAMP，GSK256066，Apremilast(CC-10004)，Roflumilast，Cilomilast，Rolipram和Milrinone中的至少一种；所述RAR激动剂为TTNPB，Bexarotene，Ch55，Tamibarotene，Retinol，AM580，ATRA，13-cisRA，VitaminA及VitaminA衍生物中的至少一种；所述ROCK抑制剂为Y-27632，Y-276322HCl，Thiazovivin，Ripasudil(K-115)，Fasudil，Fasudil(HA-1077)HCl，GSK429286A，RKI-1447和PKI-1313中的至少一种；所述JNK抑制剂为SP600125，JNKInhibitorIX，AS601245，AS602801和JNK-IN-8中的至少一种；所述DNMT抑制剂为RG108，Thioguanine，5-Aza-2'-deoxycytidine(Decitabine)，SGI-1027，Zebularine和5-Azacytidine(AZA)中的至少一种；所述HMT抑制剂为EPZ004777，EPZ5676，GSK503，BIX01294和SGC0946中的至少一种。所述组蛋白去甲基化酶抑制剂包括parnate(tranylcypromine)，Tranylcypromine(2-PCPA)HCl，SP2509，4SC-202，ORY-1001(RG-6016)，GSKJ1和GSK-LSD1中的至少一种。4.如权利要求2所述的小分子化合物组合，其特征在于，所述小分子化合物组合为选自下述第一阶段小分子化合物的任一项和第二阶段小分子化合物的任一项的时序性小分子化合物组合，所述时序性小分子化合物组合所属的小分子化合物必须按一定的时序与相应的细胞或细胞产物接触；所述第一阶段小分子化合物采用下列任一项：VPA+CHIR99021+Repsox+Forskolin；VPA+BIO+Repsox+Forskolin；VPA+CHIR99021+Repsox+Rolipram；VPA+CHIR99021+SB431542+Forskolin；VPA+CHIR99021+SB431542+Rolipram；VPA+BIO+SB431542+Forskolin；VPA+BIO+SB431542+Roli...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡敏，李燕皎，王兆杰，
申请(专利权)人：昆明学院，云南省科学技术院，
类型：发明
国别省市：云南,53