一种牛种布氏菌弱毒疫苗株S19的检测方法技术

本发明专利技术提供一种种牛种布氏菌弱毒疫苗株S19的检测方法和检测用的引物组，其中所使用的引物组的序列为SEQ ID NO:1‑4。本发明专利技术引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：30min即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为1.0×10

Detection method of a Brucella attenuated strain S19

The present invention provides a detection method and a primer group for a variety of Brucella vaccine strain S19, in which the sequence of the primer group is SEQ ID NO:1 4. The advantages of the primer group and the method are as follows: 1) high sensitivity and sensitivity: 30min can complete the amplification, and the minimum detection limit of the amplification template is 1 * 10

【技术实现步骤摘要】
一种牛种布氏菌弱毒疫苗株S19的检测方法
本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种牛种布氏菌弱毒疫苗株S19的重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification，RPA)快速鉴别方法。
技术介绍
布氏菌病(简称布病)是由布氏菌引起的全球广泛流行的人兽共患传染病，对畜牧业及公共卫生安全造成严重威胁。近年来我国布病疫情防治形势严峻，呈现由牧区向非牧区转移，由职业人群向非职业人群扩散的趋势。对家畜进行弱毒疫苗免疫能遏制布病向人间传播，但弱毒疫苗的免疫会对布病的诊断和监测造成干扰。实现布氏菌弱毒疫苗株与野生型菌株的鉴别，对于布病防控工作具有重要意义。布氏菌S19株是国际上广泛应用的布氏菌弱毒疫苗株之一，也是世界动物卫生组织(OIE)推荐的弱毒疫苗株。S19株能持续刺激机体产生抗体，广泛应用于牛的免疫接种。S19株属于光滑型布氏菌，含有LPS脂多糖，动物免疫后产生的抗体无法与自然感染相区分，给布病诊断带来困难。而布氏菌分离鉴定需要在生物安全三级实验室进行，且耗时长，对人员和设备要求较高。分子生物学技术的发展，为S19株的快速鉴别提供了手段，国际上已先后建立基于PCR和荧光定量PCR方法鉴别S19株的方法。RPA是近年一种新开发的恒温核酸扩增技术，该方法能在36～40℃恒温条件下于20min内大量扩增目的基因以完成检测，具有特异性强、灵敏度高、反应速度快、操作简便等优点。与常规的PCR和荧光定量PCR方法相比，PRA反应条件为恒温，不需要进行变性、退火、延伸循环，对实验仪器设备依赖少且反应速度快，特别适用于现场检测。目前该技术已经在一些病原快速检测方面得到应用，但还没有基于RPA技术鉴别S19株的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种牛种布氏菌弱毒疫苗株S19的RPA快速鉴别检测方法，从而弥补现有布氏菌检测技术的不足。本专利技术首先提供一组用于鉴别S19株的RPA引物组，引物信息如下：Omp2-F:CGTGCGGCATGTAACCGTCGATCGTGTAATC(SEQIDNO:1)、Omp2-R:TGCATATATCACGCTTGGTGGTTTCAAGGTT(SEQIDNO:2)、S19E-F:CGCTAACCCGGACGACTACGATCCTTACGCAT(SEQIDNO:3)、S19E-R:GGCAGATTTCATTATCCACCGCGCCGCCTTC(SEQIDNO:4)；本专利技术还提供一种利用上述RPA引物组检测S19株的方法，包括如下的步骤：1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)提取细菌DNA；2)RPA步骤：将本专利技术设计RPA引物组及各反应组分，分别加入反应体系中，39℃反应30min。3)结果检测：回收纯化RPA反应产物，2％琼脂糖凝胶电泳检测，判定检测结果。另一方面，本专利技术的RPA引物组可用于制备检测试剂盒。本专利技术引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：30min即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为1.0×10-3ng/μl；2)特异性强：采用两对PRA引物组特异性对S19进行鉴别检测，与其他种、生物型的布氏菌、布氏菌疫苗株及常见非布氏菌株，无交叉反应；3)操作简便：配置好的RPA反应体系，置于39℃恒温条件下完成反应，不需要使用PCR仪；4)高通量：可在水浴或恒温培养箱中一次性进行大量样品检测，不受PCR仪设备检测孔数量限制。附图说明图1：RPA方法检测S19株和非S19布氏菌株的凝胶电泳图条带1为DL1000DNAMarker；条带2为Omp2引物检测S19株基因组DNA模版；条带3为S19E引物检测S19株基因组DNA模版；条带4为Omp2引物检测非S19布氏菌代表株M5-90基因组DNA模版；条带5为S19E引物检测M5-90株基因组DNA模版；条带6为Omp2引物检测阴性对照；条带7为S19E引物检测阴性对照。图2:RPA方法灵敏度检测凝胶电泳图(含图2a和2b)图2a.采用RPA方法检测系列稀释的S19株基因组DNA模版，模版浓度为10ng/μl～1.0×10-4ng/μl。其中，条带2～7为Omp2引物检测结果，条带9～14为S19E引物检测结果。具体如下：条带1和8为DL1000Marker；条带2和9为10ng/μl；条带3和10为1ng/μl；条带4和11为1.0×10-1ng/μl；条带5和12为1.0×10-2ng/μl；条带6和13为1.0×10-3ng/μl；条带7和14为1.0×10-4ng/μl。图2b.采用RPA方法检测系列稀释非S19布氏菌代表株M5-90基因组DNA模版，模版浓度为10ng/μl～1.0×10-4ng/μl。其中，条带2～7为Omp2引物检测结果，条带9～14为S19E引物检测结果。具体如下：条带1和8为DL1000Marker；条带2和9为10ng/μl；条带3和10为1ng/μl；条带4和11为1.0×10-1ng/μl；条带5和12为1.0×10-2ng/μl；条带6和13为1.0×10-3ng/μl；条带7和14为1.0×10-4ng/μl。图3:RPA方法特异性检测凝胶电泳图(含图3a、3b和3c)图3a和3b.采用PRA方法检测布氏菌常见种、生物型参考株与布氏菌疫苗株的基因组DNA模版。其中，图3a为Omp2引物检测结果，图3b为S19E引物检测结果。具体如下：条带1，DL1000DNAMarker；条带2,Brucellasuisbiovar1S1330；条带3,B.suisbiovar2Thomsen；条带4,B.suisbiovar3686；条带5,B.suisbiovar440；条带6,B.abortusbiovar1A544；条带7,B.abortusbiovar286/8/59；条带8,B.abortusbiovar3Tulya；条带9,B.abortusbiovar4292；条带10,B.abortusbiovar5B3196；条带11,B.abortusbiovar6870；条带12,B.abortusbiovar763/75；条带13,B.abortusbiovar9C68；条带14,B.melitensisbiovar116M；条带15,B.melitensisbiovar263/9；条带16,B.melitensisbiovar3Ether；条带17,B.ovis63/290；条带18,B.canisRM6/66；条带19,B.neotomae5K33；条带20,S19；条带21,M5-90；条带22,S2；条带23,A19；条带24,阴性对照；条带25，阳性对照。图3c.采用PRA方法检测四种常见非布氏菌株基因组DNA模版。其中，条带1～7为Omp2引物检测结果，条带8-14为S19E引物检测结果。具体如下：条带1和8，DL1000DNAMarker；条带2和9，EscherichiacoliK99；条带3和10，PasteurellamultocidaC48-1；条带4和11，StreptococcussuisST171；条带5和12，PseudomonasaeruginosaDI-1；条带6和13,阴性对照；条带本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴别牛种布氏菌弱毒疫苗株S19株的引物组，其特征在于，所述的引物组包含有两对引物；其中第一引物对的上游引物的序列为SEQ ID NO:1；下游引物的序列为SEQ ID NO:2；第二引物对的上游引物的序列为SEQ ID NO:3；下游引物的序列为SEQ ID NO:4。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别牛种布氏菌弱毒疫苗株S19株的引物组，其特征在于，所述的引物组包含有两对引物；其中第一引物对的上游引物的序列为SEQIDNO:1；下游引物的序列为SEQIDNO:2；第二引物对的上游引物的序列为SEQIDNO:3；下游引物的序列为SEQIDNO:4。2.权利要求1所述的引物组在制备检测牛种布氏菌弱毒疫苗株S19株的制品中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的制品为检测试剂盒。4.一种检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求1所述的引物组。5.权利要求4所述的试剂盒在检测牛种布氏菌弱毒疫苗株S19株中的应用。6.一种检测牛种布氏菌弱毒疫苗株S19株的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒提取待检测样品的细菌DNA；2)RPA步骤：将权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈义平，秦立得，南文龙，谭鹏飞，巩明霞，张凤霞，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：山东,37