一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取和建库方法技术

本发明专利技术属于微生物分子生物学检测技术领域，具体公开了一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法，包括第一次痰液液化、第二次痰液液化、微生物破壁、DNA提取和核酸质量检测等步骤。本发明专利技术还公开了一种痰液微生物宏基因组建库方法，包括样品基因组DNA提取、基因组DNA处理、文库扩增、文库初纯化、两步法片段选择和上机检测等步骤。本发明专利技术采用胰蛋白酶和SDS联合的温柔型消化法，将宿主基因组释放于溶液中，获得保留完整细胞壁结构的微生物，实现去宿主化微生物核酸提取。本发明专利技术所提供的提取方法及建库方法兼容性好，可广泛用于主流测序平台，具有灵活简便、高效快捷、节约成本的优点，具有较好的推广应用前景。

A method to extract and build a microbial macrogenomic DNA from sputum

The invention belongs to the technical field of microbial molecular biology detection, and specifically discloses a method for the extraction of microorganism macrogenomics from the sputum, including the first sputum liquefaction, second sputum liquefaction, microbiological wall breaking, DNA extraction and nucleic acid quality detection and so on. The invention also disclosed a method for the establishment of microgenome microgenome Library of sputum, including the extraction of genomic DNA, genomic DNA, library amplification, library initial purification, two step selection and machine detection. The present invention adopts the gentle digestion method of combination of trypsin and SDS to release the host genome into the solution to obtain the microorganism with the intact cell wall structure, and to achieve the nucleic acid extraction of the host microorganism. The extraction method and construction method provided by the invention have good compatibility, and can be widely used in the mainstream sequencing platform. It has the advantages of flexible, convenient, efficient and fast and cost saving, and has a good prospect of popularization and application.

【技术实现步骤摘要】
一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取和建库方法
本专利技术涉及微生物分子生物学检测
，具体地，涉及一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取和建库方法。
技术介绍
近年来微生物宏基因组领域的研究越来越热门，尤其是在人体肠道微生物与人类健康方面取得了重大进展，但呼吸道微生物方面却因为呼吸道样品处理和建库较困难，进展缓慢。呼吸道微生物方面研究的主要是呼吸道疾病，如重症肺炎、肺结核、囊性纤维化病、流感等带有传染性的疾病。这些疾病常见的样品类型为唾液、痰液、气道灌洗液等，常见菌有金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、溶血性链球菌、肠杆菌科细菌、结核分枝杆菌、乙肝病毒、厌氧链球菌、米勒链球菌、拟杆菌属、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、呼吸道真菌、呼吸道病毒等，这些病原微生物多数为《人间传染的病原微生物名录》危害程度分类为二类、三类高传染、高致病性的微生物，且要求在基础实验室-二级生物安全水平（BSL-2）进行处理，即有配套微生物处理规范的病毒房里进行实验操作。因此，对工作人员及科研单位要求较高，目前常规医院及科研公司尚未具备相应条件，而无法开展实验。常见样本中的痰液痰核粘稠坚硬，气道灌洗液中也含有痰液或血液，在进行核酸提取前，需要进行液化，才能将痰液里面的细菌DNA释放出来，进而使用过柱法或者磁珠法进行核酸提取。目前，痰液的液化和核酸提取主要有以下四种方法：（1）直接水煮法，煮沸10min后将上清液进行PCR扩增检测反应，该法方便快捷、成本低，但容易造成部分液化不全、基因组断裂；（2）先用4%或1MNaOH溶液液化处理后再提取，该法试剂来源方便、反应时间足够长，能够完全液化痰液，但碱性较强，容易将宿主和细菌的DNA均变性、解链，使DNA降解严重；（3）先用巯基乙醇等变性剂变性和超声波法联合预处理后再提取，该法能在一定程度上液化痰液，但巯基乙醇具有剧烈毒性和挥发性气味，且超声会使宿主和微生物的DNA均被碎片化；（4）加入0.2mg/mL蛋白酶K，于55℃条件下水浴3h或者过夜消化后再提取，只要酶足够多、时间足够长，可以完全实现液化，但该法成本较高、蛋白酶K消耗大、时间较长。以上方法均可有助于痰液液化，完成检测工作，可应用于细菌致病基因靶标扩增、细菌16SrRNA基因测序、细菌涂片等一些可以忽略宿主基因组的检测中，还可用于分枝结核杆菌等具有较厚细胞壁、难裂解的革兰式阳性菌检测。但是，宏基因测序会将提取到的所有核酸均测序出来，如使用上述方法，则这类样本的测序数据中，宿主基因组可能占99.9%，测序数据基本浪费。如何解决去宿主化提取是痰液宏基因测序的关键之一。就微生物建库策略而言，目前的DNA建库方法主要有三种：（1）超声波和经典DNA建库方法，包括末端修复、接头连接、文库扩增等步骤，该法测序片段随机性、均一性最好，但片段主峰分布范围大，需要较高的DNA起始量；（2）DNA酶切基因组和经典DNA建库方法，该法可快捷完成片段化反应，需要的DNA起始量较超声波少，但片段化随机性效果次之，且需要增加酶成本；（3）转座酶建库法，其特点是转座酶切割DNA的同时，连接上部分测序接头，再进行文库扩增，该法速度最快，在剪切的同时和连接接头一起完成，目前主要应用于人全基因组及外显子测序。而目前现有的转座酶建库试剂盒尚不能同时满足多种文库类型及多种测序平台，达到高效、准确定量的要求。目前呼吸道宏基因组测序研究中尚未有专门针对痰液微生物去宿主基因组的核酸提取方法和试剂盒，以及完善的低起始量、快速建库方法。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术的上述不足，提供一种用于痰液微生物宏基因组去宿主化提取的工作液，通过胰蛋白酶和SDS对痰液进行温柔消化，且不破坏微生物细胞壁，进而实现去宿主化核酸提取。本专利技术的另一目的在于提供一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法。本专利技术的另一目的在于提供一种痰液微生物宏基因组建库方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：一种用于痰液微生物宏基因组去宿主化提取的工作液，包括第一次痰液液化工作液和第二次痰液液化工作液；所述第一次痰液液化工作液由胰蛋白酶和TB1buffer组成；所述TB1buffer包含如下终浓度的各组分：45～55mMCaCl2、132～142mMNaCl、2.2～3.2mMKCl、9.5～10.5mMNa2HPO4•12H2O和1.5～2.5mMKH2PO4，pH值为7～9；所述第二次痰液液化工作液由TB2buffer组成，包含如下终浓度的各组分：5～15mMTris-HCl、10～20mMEDTA、0.5～1.5%TritonX-100、0.2～0.3%(w/v)SDS、45～55mMDTT和15～25mMHEPS-KOH，pH值为8.0。本专利技术通过胰蛋白酶对痰液进行温柔消化，且不破坏微生物细胞壁，进而实现去宿主化核酸提取。同时进行痰液的液化和去宿主化处理，含Ca2+的磷酸盐缓冲液环境对该酶具有增强和稳定效果。本专利技术还通过TB2buffer对残留的成絮痰液进行二次消化，裂解宿主细胞膜，将宿主基因组释放于溶液中，而微生物仍保持完整的细胞壁。其中，Tris-HCl（pH8.0）能提供弱碱性，对DNA的碱基有保护性，不易破坏其完整性或产生开环及断裂；EDTA为金属螯合剂，能抑制核酸酶对裂解后暴露于细胞外的DNA的降解，终止胰蛋白酶反应；TritonX-100和HEPS-KOH具有增加细胞脂质溶解的作用；SDS具有强渗透力，可以切断痰液中蛋白质的二硫键；DTT具有强氧化作用，阻止蛋白质分子内或分子间二硫键的形成。优选地，所述胰蛋白酶活力为1：2500、1：250或1：300，要求现配现用。更优选地，所述胰蛋白酶为胰蛋白酶干粉，酶活力为1：2500，反应温度为37℃，pH值为7.5～8.5，此时的酶活力最佳。优选地，所述TB1buffer包含如下终浓度的各组分：50mMCaCl2、137mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa2HPO4•12H2O和2mMKH2PO4，pH值为7～9。优选地，所述TB2buffer包含如下终浓度的各组分：10mMTris-HCl、15mMEDTA、1%TritonX-100、0.25%(w/v)SDS、50mMDTT和20mMHEPS-KOH，pH值为8.0。一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法，包括以下步骤：第一次痰液液化、第二次痰液液化、微生物破壁、DNA提取和核酸质量检测；所述第一次痰液液化为取痰液样品，加入0.5～3倍体积上述第一次痰液液化工作液，混匀后25～40℃孵育15～30min，每5min摇晃一次；当痰液变清亮时，即停止反应；所述第二次痰液液化为向第一次痰液液化后的反应液中加入0.5～3倍体积上述第二次痰液液化工作液，混匀后室温孵育10min，离心后弃去上清液，向沉淀中再加入3～6mLTB2buffer，离心后保留微生物沉淀。本专利技术通过胰蛋白酶对痰液进行温柔消化，且不破坏微生物细胞壁；要求严格控制痰液液化的时间，当痰液液化呈流动液态、溶液清亮即停止反应，使细胞和细菌从粘稠的絮状痰液中分离出来。若液化时间过长，过度消化，会损伤微生物细胞壁，影响去宿主化核酸提取效果。本专利技术还通过TB2buffer对残留的成絮痰液进行二次消化，裂解宿主细胞膜，将其宿主基因组释本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于痰液微生物宏基因组去宿主化提取的工作液，其特征在于，包括第一次痰液液化工作液和第二次痰液液化工作液；所述第一次痰液液化工作液由胰蛋白酶和TB1 buffer组成；所述TB1 buffer包含如下终浓度的各组分：45～55mM CaCl2、132～142mM NaCl、2.2～3.2mM KCl、9.5～10.5mM Na2HPO4•12H2O和1.5～2.5mM KH2PO4，pH值为7～9；所述第二次痰液液化工作液由TB2 buffer组成，包含如下终浓度的各组分：5～15mM Tris‑HCl、10～20mM EDTA、0.5～1.5% Triton X‑100、0.2～0.3%(w/v) SDS、45～55mM DTT和15～25mM HEPS‑KOH，pH值为8.0。

【技术特征摘要】
1.一种用于痰液微生物宏基因组去宿主化提取的工作液，其特征在于，包括第一次痰液液化工作液和第二次痰液液化工作液；所述第一次痰液液化工作液由胰蛋白酶和TB1buffer组成；所述TB1buffer包含如下终浓度的各组分：45～55mMCaCl2、132～142mMNaCl、2.2～3.2mMKCl、9.5～10.5mMNa2HPO4•12H2O和1.5～2.5mMKH2PO4，pH值为7～9；所述第二次痰液液化工作液由TB2buffer组成，包含如下终浓度的各组分：5～15mMTris-HCl、10～20mMEDTA、0.5～1.5%TritonX-100、0.2～0.3%(w/v)SDS、45～55mMDTT和15～25mMHEPS-KOH，pH值为8.0。2.根据权利要求1所述用于痰液微生物宏基因组去宿主化提取的工作液，其特征在于，所述胰蛋白酶活力为1：2500、1：250或1：300。3.根据权利要求1所述用于痰液微生物宏基因组去宿主化提取的工作液，其特征在于，所述TB1buffer包含如下终浓度的各组分：50mMCaCl2、137mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa2HPO4•12H2O和2mMKH2PO4，pH值为7～9。4.根据权利要求1所述用于痰液微生物宏基因组去宿主化提取的工作液，其特征在于，所述TB2buffer包含如下终浓度的各组分：10mMTris-HCl、15mMEDTA、1%TritonX-100、0.25%(w/v)SDS、50mMDTT和20mMHEPS-KOH，pH值为8.0。5.一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法，其特征在于，包括以下步骤：第一次痰液液化、第二次痰液液化、微生物破壁、DNA提取和核酸质量检测；所述第一次痰液液化为取痰液...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍泳彰，陈杰，
申请(专利权)人：广州赛哲生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44