用于检测印第安纳沙门菌的引物组、该引物组的用途、包含该引物组的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术属于细菌检测技术领域，具体涉及用于检测印第安纳沙门菌的引物组、该引物组的用途、包含该引物组的试剂盒及其检测方法。引物组包括三对引物，DP1s和DP2a、CF和CR以及Biotin‑DFs和6‑FAM‑DRa引物，所述DP1s的序列如SEQ ID NO.1所示，所述DP2a的序列如SEQ ID NO.2所示；所述CF的序列如SEQ ID NO.3所示，所述CR的序列如SEQ ID NO.4所示，所述Biotin‑DFs的序列如SEQ ID NO.5所示，所述6‑FAM‑DRa的序列如SEQ ID NO.6所示，所述Biotin‑DFs的5’端标记有生物素荧光基团，所述6‑FAM‑DRa的5’端标记有6‑羧基荧光素基团。本发明专利技术的优点在于，本发明专利技术提供的用于检测印第安纳沙门菌的引物组和包含该引物组的试剂盒可以特异性检测印第安纳沙门菌，且包含该引物组的试剂盒最低能检测10

Primer group for detecting Salmonella Indiana, usage of the primer group, kit containing the primer group and detection method thereof

The invention belongs to the field of bacterial detection technology, in particular to a primer group for the detection of Salmonella Indiana, the use of the primer group, a kit containing the primer group and a detection method. The primer group consists of three pairs of primers, DP1s and DP2a, CF and CR, and Biotin DFs and 6 DRa primers, as shown in the sequence of SEQ, as shown in the ID NO.1. The sequence of the 6 FAM DRa DRa shows that the 5 'end of the Biotin FAM DFs is marked with a biotin fluorescent group, and the 5' end of the 6 FAM DRa DRa is marked with 6 carboxyl fluorescein groups. The advantage of the invention is that the primer group for detecting Salmonella Indiana and the kit containing the primer group can specifically detect the Salmonella of Indiana, and the kit containing the primer group can detect the minimum of 10.

【技术实现步骤摘要】
用于检测印第安纳沙门菌的引物组、该引物组的用途、包含该引物组的试剂盒及其检测方法
本专利技术属于细菌检测
，具体涉及用于检测印第安纳沙门菌的引物组、该引物组的用途、包含该引物组的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
印第安纳沙门菌(1,4,12:z:1,7)属于沙门菌属，革兰氏阴性肠杆菌科。该血清型沙门菌为人畜共患病病原菌，其宿主谱广泛，能感染猪、羊和鸡等畜禽，当人们接触染菌的活畜禽或食用染菌的畜禽肉引起感染，导致严重的腹泻和呕吐症状，严重威胁着人类健康和肉质食品安全。目前，一般采用传统的分离鉴定和血清型鉴定印第安纳沙门菌，这类方法鉴定周期长、费时费力，不能满足快速检测的要求。因此，研发一种快速且灵敏的印第安纳沙门菌的检测试剂盒刻不容缓。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术目的在于提供一种用于检测印第安纳沙门菌的引物组、该引物组的用途、包含该引物组的试剂盒及其检测方法。本专利技术所采用的技术方案为：一种用于检测印第安纳沙门菌的引物组，所述引物组包括三对引物，其中第一对引物为DP1s和DP2a，第二对引物为CF和CR，第三对引物为Biotin-DFs和6-FAM-DRa，所述DP1s的序列如SEQIDNO.1所示，所述DP2a的序列如SEQIDNO.2所示；所述CF的序列如SEQIDNO.3所示，所述CR的序列如SEQIDNO.4所示，所述Biotin-DFs的序列如SEQIDNO.5所示，所述6-FAM-DRa的序列如SEQIDNO.6所示，所述Biotin-DFs的5’端具有生物素荧光基团标记，所述6-FAM-DRa的5’端有6-羧基荧光素基团标记。本专利技术还提供了一种用于检测印第安纳沙门菌的试剂盒，包括前述本专利技术的引物组、PCR扩增试剂、阳性质控品和阴性质控品，其中阳性质控品为印第安纳沙门菌基因组DNA，所述阴性质控品为双蒸水。上述用于检测印第安纳沙门菌的试剂盒，所述PCR扩增试剂包括浓度为10mM/L的DeoxynucleotideSolutionMix、浓度为100mM/L的MagnesiumSulfateSolution、浓度为10×的IsothermalAmplificationBuffer和浓度为8.0U/μL的Bst3.0DNAPolymerase。本专利技术还提供了一种采用上述试剂盒检测印第安纳沙门菌的方法，包括以下步骤：(1)准备待测DNA样品：按常规DNA提取方法提取待测样本的DNA；(2)配置三组PCR反应液：第一组依次加入引物组包含的三对引物、PCR扩增试剂和待测DNA样品；第二组依次加入引物组包含的三对引物、PCR扩增试剂和阳性质控品；第三组依次加入引物组包含的三对引物、PCR扩增试剂和阴性质控品；(3)PCR反应：将步骤(2)中配置好的三组PCR反应液离心混匀，分别放入恒温水浴锅中进行PCR反应；(4)检测：将反应完成的三组PCR反应液分别滴加在核酸检测试纸条上，判断结果。具体的，上述的检测印第安纳沙门菌的方法，上述步骤(3)中所述PCR反应的反应温度为63C，反应时间为1h。具体的，上述的检测印第安纳沙门菌的方法，步骤(2)中配置所得三组PCR反应液的体积均为25μL；每组PCR反应液中各组分的加样量为：IsothermalAmplificationBuffer为2.5μL，DeoxynucleotideSolutionMix为3.5μL，MagnesiumSulfateSolution为1.5μL，Bst3.0DNAPolymerase为1.0μL，DP1s为1.0μL，DP2a为1.0μL，CF为0.5μL，CR为0.5μL，Biotin-DFs为0.25μL，6-FAM-DRa为0.25μL，待测DNA样品或阳性质控品或阴性质控品为2.0μL，余量用双蒸水补齐。本专利技术还提供了一种上述引物组在检测印第安纳沙门菌中的应用。进一步的，上述应用包括将所述引物组用于制备检测印第安纳沙门菌的试剂盒。本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术根据印第安纳沙门菌的基因序列设计了三对特异性引物组，可以专一性鉴别印第安纳沙门菌，确保了测序结果的准确性和特异性。(2)相比于传统分离鉴定和血清型鉴定方法，本专利技术提供的用于检测印第安纳沙门菌的试剂盒采用交叉引物恒温扩增技术设计三对特异性引物以检测印第安纳沙门菌，只需要在恒温水浴锅中扩增1小时就能够检测印第安纳沙门菌，具有特异性强、灵敏度高和检测速度快的特点。(3)本专利技术提供的引物组可以广泛用于检测印第安纳沙门菌，也可用作制备检测印第安纳沙门菌的试剂盒。附图说明图1是本专利技术中的用于检测印第安纳沙门菌的引物组的引物相对位置关系；图2是本专利技术的实施例4中核酸检测试纸条的检测结果图；图3是本专利技术的实施例5中核酸检测试纸条的检测结果图。具体实施方式下面结合附图及具体实施例对本专利技术做进一步阐释。实施例1本实施例的目的在于提供用于检测印第安纳沙门菌的三对特异性引物。依据NCBI上公开的印第安纳沙门菌的基因组序列(CP022450.1和CP015724.1)，根据引物设计原则和交叉引物扩增技术原理设计三对引物，第一对引物为DP1s和DP2a，第二对引物为CF和CR，第三对引物为Biotin-DFs和6-FAM-DRa。DP1s和DP2a为链置换引物，Biotin-DFs和6-FAM-DRa为探针引物，DP1s和DP2a的相对位置如图1标记所示，Biotin-DFs和6-FAM-DRa的相对位置如图1标记所示。所述DP1s的序列如SEQIDNO.1所示，所述DP2a的序列如SEQIDNO.2所示；所述Biotin-DFs的序列如SEQIDNO.5所示，所述6-FAM-DRa的序列如SEQIDNO.6所示，所述Biotin-DFs的5’端具有生物素荧光基团(Biotin)标记，所述6-FAM-DRa的5’端有6-羧基荧光素基团标记(6-FAM)标记。CF的序列通过图1所示PRa标记位置序列的反向互补序列加上“TCTAGA”六个碱基再组合上PFs标记位置序列设计而成，CF的序列最终如SEQIDNO.3所示。CR的序列通过图1所示PFs标记位置序列加上“TCTAGA”六个碱基再组合上PRa标记位置序列的反向互补序列设计而成，CR的序列最终如SEQIDNO.4所示。将设计的三对特异性引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成分别得到DP1s和DP2a、CF和CR以及Biotin-DFs和6-FAM-DRa，对所得到的DP1s和DP2a、CF和CR以及Biotin-DFs和6-FAM-DRa进行基因测序验证确认。通过这三对引物扩增得到印第安纳沙门菌DNA部分序列片段，所述印第安纳沙门菌DNA部分序列片段序列如表1中SEQIDNO.7所示。表1实施例2本实施例的目的在于提供一种用于检测印第安纳沙门菌的试剂盒。一种用于检测印第安纳沙门菌的试剂盒，包括实施例一中的DP1s和DP2a、CF和CR以及Biotin-DFs和6-FAM-DRa三对引物、PCR扩增试剂、阳性质控品和阴性质控品，其中阳性质控品为印第安纳沙门菌基因组DNA，所述阴性质控品为双蒸水。实施例3本实施例的目的在于提供一种用于检测印第安纳沙门菌的试剂盒。一种用于检测印第安纳沙门菌的试剂盒，包括以下组分：(本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测印第安纳沙门菌的引物组，其特征在于：所述引物组包括三对引物，其中第一对引物为DP1s和DP2a，第二对引物为CF和CR，第三对引物为Biotin‑DFs和6‑FAM‑DRa，所述DP1s的序列如SEQ ID NO.1所示，所述DP2a的序列如SEQ ID NO.2所示；所述CF的序列如SEQ ID NO.3所示，所述CR的序列如SEQ ID NO.4所示，所述Biotin‑DFs的序列如SEQ ID NO.5所示，所述6‑FAM‑DRa的序列如SEQ ID NO.6所示，所述Biotin‑DFs的5’端有生物素荧光基团标记，所述6‑FAM‑DRa的5’端有6‑羧基荧光素基团标记。

【技术特征摘要】
1.用于检测印第安纳沙门菌的引物组，其特征在于：所述引物组包括三对引物，其中第一对引物为DP1s和DP2a，第二对引物为CF和CR，第三对引物为Biotin-DFs和6-FAM-DRa，所述DP1s的序列如SEQIDNO.1所示，所述DP2a的序列如SEQIDNO.2所示；所述CF的序列如SEQIDNO.3所示，所述CR的序列如SEQIDNO.4所示，所述Biotin-DFs的序列如SEQIDNO.5所示，所述6-FAM-DRa的序列如SEQIDNO.6所示，所述Biotin-DFs的5’端有生物素荧光基团标记，所述6-FAM-DRa的5’端有6-羧基荧光素基团标记。2.一种用于检测印第安纳沙门菌的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物组、PCR扩增试剂、阳性质控品和阴性质控品，其中阳性质控品为印第安纳沙门菌基因组DNA，所述阴性质控品为双蒸水。3.根据权利要求2所述的用于检测印第安纳沙门菌的试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂包括浓度为10mM/L的DeoxynucleotideSolutionMix、浓度为100mM/L的MagnesiumSulfateSolution、浓度为10×的IsothermalAmplificationBuffer和浓度为8.0U/μL的Bst3.0DNAPolymerase。4.一种采用权利要求3所述的试剂盒检测印第安纳沙门菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)准备待测DNA样品：按常规DNA提取方法提取待测样本的DNA；(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：王红宁，王勇祥，张安云，雷昌伟，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51