一株2，4-二硝基甲苯磺酸盐高效降解菌株Sphingomonas sp.X4及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株2，4‑二硝基甲苯磺酸盐高效降解菌株Sphingomonas sp.X4及其应用。该菌株已于2017年9月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.14585。本发明专利技术还公开了筛选2,4‑二硝基甲苯磺酸盐高效降解菌株的方法以及应用此菌株降解TNT红水及红水污染土壤的使用方法。将上述菌株培养至对数生长期，接种到2，4‑DNT‑3‑SA和2，4‑DNT‑5‑SA浓度分别为500mg/kg的污染土壤中，经过4‑6天处理后，两种2,4‑二硝基甲苯磺酸盐的去除率均达到100％。该菌株硝基化合物类有机污染土壤修复中具有很好的应用。

A 2, 4- two nitrotoluene sulfonate highly effective strain Sphingomonas sp.X4 and its application

The invention discloses a 2, 4, two nitro toluene sulfonate highly effective degradation strain Sphingomonas sp.X4 and its application. The strain was preserved in the Chinese traditional microorganism preservation management center in September 15, 2017, and its preservation number is CGMCC NO.14585. The invention also discloses a method for screening 2,4 two nitro toluene sulfonate degrading strain, and the method of using the strain to degrade TNT red water and red water contaminated soil. The above strains were cultured in logarithmic growth period, inoculated to 2, 4, DNT 3 SA and 2, 4 DNT 5 SA respectively in 500mg/kg contaminated soil. After 4 6 days treatment, the removal rate of two 2,4 two nitrotoluene sulfonate was up to 100%. The strain has good application in the remediation of nitro compounds contaminated soil.

【技术实现步骤摘要】
一株2，4-二硝基甲苯磺酸盐高效降解菌株Sphingomonassp.X4及其应用
本专利技术属于环境生物领域，具体涉及一株TNT红水污染土壤中主要污染物2,4-二硝基甲苯磺酸盐降解菌株Sphingomonassp.X4的分离及应用
技术介绍
TNT红水是TNT废水的一种，产生于TNT精制过程。三段硝化法制得的TNT粗品大概含有4.5％的同分异构体，主要是2,4,5－和2,3,4－三硝基甲苯。为达到军用纯度，通常采用亚硫酸钠精制法对TNT粗品进行精制，去除这些同分异构体。亚硫酸钠可与TNT的同分异构体进行反应，分别生成2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA，是TNT红水中的主要成分。TNT红水的渗漏造成了严重的土壤污染问题。土壤生物修复技术发源于20世纪80年代，与物理和化学法相比，生物修复技术具有成本相对较低、处理效果较好、操作简单、不易造成二次污染、能实施原位处理等优点，成为一种高效、经济和生态友好型的修复技术，是当前土壤修复技术研究领域的前沿，且具有实际应用价值。许多学者分离出了能应用于火炸药污染物降解的菌株。Duque等首次从TNT污染土壤中分离出能降解TNT的细菌—假单胞杆菌C1S1，该细菌能够将TNT、2,4-DNT，2-MNT作为唯一氮源。Oh等人从TNT污染土壤中分离出绿脓杆菌属，该均属能产生硝基还原酶促进TNT的降解。Nyanhongo等人从TNT污染水体和土壤中分离出假单胞菌属GG04和芽孢杆菌SF，能够杨浦晓得降解TNT。Gumuscu等人分离出了无色菌STE11，能将TNT作为唯一的氮源，主要转化为DNT、AMNT。Khan等人从TNT污染场地中分离出新型嗜甲基菌属，该菌群在加入淀粉强化情况下能将TNT苯环开环且不产生其它有毒副产物。但是，尚未有研究指出在土壤中分离出可以降解二硝基甲苯磺酸盐的微生物。本专利技术从土壤中分离出一株可以降解二硝基甲苯磺酸盐的工程菌株并将其制成菌液，投加到TNT红水污染土壤中进行土壤修复。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有TNT红水及TNT红水污染土壤修复技术的缺陷和不足，提供一株2,4-二硝基甲苯磺酸盐高效降解菌及其应用。为实现上述专利技术的目的，本专利技术的技术方案为：一株2，4-二硝基甲苯磺酸盐高效降解菌株鞘氨醇单胞菌属Sphingomonassp.X4，于2017年9月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNO.14585，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本专利技术所提供的高效降解菌株Sphingomonassp.X4从甘肃省白银TNT红水污染土壤中富集、驯化、分离纯化得到。菌落呈黄色，圆形隆起，表面光滑湿润，易挑取，革兰氏染色阴性。在显微镜下细胞呈杆状。上述菌株的16SrRNA基因序列特征，采用分析法将序列与数据库进行比对分析，发现该菌株属于鞘氨醇菌属(Sphingomonassp.)，其DNA序列表如下文所示。上述2,4-二硝基甲苯磺酸盐降解菌株Sphingomonassp.X4或其菌悬液在降解硝基芳香族炸药(TNT、DNT、MNT等)方面的应用也在本专利技术的保护范围之内。上述应用的具体方法为：使用前将降解菌株Sphingomonassp.X4在LB液体培养基中，30℃条件下活化至对数生长期，将菌液以5-10％的接种量接种于TNT红水或污染土壤中。优选的，所述的降解的最佳条件为：10％的接种量，液土比为2:5，温度为30℃，pH为7。附图说明图1为菌株Sphingomonassp.X4的群落形态图2为菌株Sphingomonassp.X4的扫描电镜图图3为菌株Sphingomonassp.X4在30℃下的生长曲线图4为Sphingomonassp.X4对两种2，4-二硝基甲苯磺酸盐的降解曲线。图5为Sphingomonassp.X4在不同pH下对两种2，4-二硝基甲苯磺酸盐的降解率。图6为Sphingomonassp.X4在不同温度下对两种2，4-二硝基甲苯磺酸盐的降解率。具体实施方式以下实施例所用试剂如下：(1)含2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA无机盐固体培养基：2，4-DNT-3-SA0.5g，2，4-DNT-5-SA0.5g，NaCl30g，NH4NO33g，KH2PO41g,K2HPO41g,CaCl20.02g,MgSO40.5g，琼脂粉20g；去离子水1L；微量元素溶液10ml。高压灭菌后取出倒置平板，凝结后备用。微量元素溶液：CuSO40.05g，MnSO40.05g,FeSO4.7H2O0.05g，去离子水50ml。(2)LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL。高压灭菌后备用。(3)LB固体培养基LB液体培养基中加入18g/L琼脂，高压灭菌后取出倒置平板，凝结后备用。实施例1：菌株Sphingomonassp.X4的分离纯化土壤样品采自甘肃省白银市(东经104°13′43.907″、北纬36°30′44.676″)，装于自封袋中，于4℃保存运回实验室。富集培养：取污染土壤10g放入装有100mlLB液体培养基的锥形瓶中，在30℃、120rpm的恒温要床上进行震荡，富集培养24h，驯化：取1ml上述培养液用涂布棒涂布到含有2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA的固体无机盐培养基中，放入恒温培养箱培养7d；分离纯化：待菌落长出后，观察菌落形态，用无菌接种环从上述固体无机盐培养基中挑选形态差距大的菌落，采用平板划线分离法接种于LB固体培养基上，置于恒温培养箱中30℃倒置培养24h，待菌落长出后挑取单菌落，并以同样的方法接种至LB固体培养基。重复上述划线分离过程，直至形成形态单一的纯化菌落。菌悬液制备：将纯化后的菌株接种到LB液体培养基中，于30℃，120rpm中培养24h，并将细胞浓度调整为109CFU/mL备用。菌株鉴定：提取菌株DNA，并采用通用引物8F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')及1513R(5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行扩增，扩增体系为2.5μL正引物、2.5μL反引物、45μL双蒸水，50μLsupermix，用纯化的单菌落作DNA模板。扩增条件为96℃预变性10min，96℃变性1sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min，共35个循环，72℃延伸5min。16SrRNA扩增后的细菌DNA样品5μL与6×载样缓冲液1μL混合后，采用1.0％的琼脂糖凝胶(5％核酸染料)进行电泳检测，所用的DNAmaker为100bpDNALadder(索莱宝)。电泳条件如下：1×TAE缓冲液，电压100V，电泳时间20min。电泳结束后利用凝胶成像系统(IsogenProxima10Phi)成像观察。将扩增产物送往美吉生物进行16SrRNA测序，将测得的16SrDNA基因序列通过Blast进行相似序列搜索，将菌株的基因序列与Genbank中的16SrDNA进行比对，利用最相似序列确定其系统发育地位。实施例2：2,4-二硝基甲苯磺酸盐降解菌株Sphingomonassp.X4的降解能力测定取未污染土壤，风干研磨、过1mm筛，备用。称取一定量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株2,4‑二硝基甲苯磺酸盐降解菌株Sphingomonas sp.X4，其特征在于，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.14585，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

【技术特征摘要】
1.一株2,4-二硝基甲苯磺酸盐降解菌株Sphingomonassp.X4，其特征在于，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNO.14585，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.如权利要求1所述的一株2,4-二硝基甲苯磺酸盐降解菌株在TNT红水和TNT红水污染土壤修复中的应用。3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，将菌株Sphingomonassp.X4培养至对数生长期，以10％的接种量添加到污染土壤中，处理4-6天。4.如权利要求2所述的应用，所述应用具体为：挑取Sphingomonassp.X4单菌落于含LB培养基的锥形瓶中，于30℃，120rpm条件下培养1d，制成种子培养液。将上述培养的种子...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶正芳，徐文杰，李智林，
申请(专利权)人：北京协同创新研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11