肾细胞癌的预后判定方法技术

本发明专利技术提供一种迅速、简便且高精度的癌预后判定方法。一种含有肾细胞癌的组织的判定方法，包括以下工序：(1)将样品DNA供于离子交换色谱的工序，该样品DNA是用亚硫酸氢盐处理由受检者的肾脏组织制备的靶基因组DNA后进行PCR扩增而得到的；(2)算出该色谱的检测信号的微分值的工序；(3)工序(2)中算出的微分值具有2个以上的极大值的情况下，将该肾脏组织判定为预后不良的含有肾细胞癌的组织的工序。

Prognostic method for renal cell carcinoma

The invention provides a rapid, simple and highly accurate method for judging the prognosis of cancer. A method of determination of tissue containing renal cell carcinoma, including the following procedure: (1) the sample DNA is supplied to the process of ion exchange chromatography, the sample DNA is obtained by PCR amplification with the target genome DNA prepared by the renal tissue of the examiner, and (2) the calculation of the differential value of the detection signal of the chromatogram. In the case of (3) the differential value calculated in process (2) has more than 2 maximum values, the renal tissue is judged to be a poor prognosis process with renal cell carcinoma.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肾细胞癌的预后判定方法
本专利技术涉及利用了甲基化DNA的检测的肾细胞癌的预后判定方法。
技术介绍
近年来，清楚地知道DNA的异常甲基化深度参与癌化，受到了关注。作为癌细胞的特异性表观遗传异常，已知有部分的基因启动子区域中的CpG岛的异常DNA甲基化。CpG岛是介由磷酸二酯键(p)的胞嘧啶(C)－鸟嘌呤(G)二碱基序列高频出现的区域，大多存在于基因上游的启动子区域。CpG岛的异常DNA甲基化通过使抑癌基因失活等而参与癌变。在大肠癌、胃癌等中，已经报告了与临床病理学因素相关的CpG岛的DNA甲基化亢进(非专利文献1～4)，这种类型的癌被称为CpG岛甲基化表型(CIMP)阳性癌。作为已经确立的甲基化DNA的分析方法，有利用亚硫酸氢盐(重亚硫酸盐、酸性亚硫酸盐、bisulfite)反应的方法。该方法是在甲基化DNA的分析中最常用的方法。如果用亚硫酸氢盐处理单链DNA，则胞嘧啶经过磺化、水解脱氨化、脱磺化而转变成尿嘧啶。另一方面，由于被甲基化的胞嘧啶最初发生的磺化的反应速度极其缓慢，所以在实际进行的亚硫酸氢盐处理的反应时间中仍保持为甲基化胞嘧啶。因此，如果使用经亚硫酸氢盐处理过的DNA进行PCR(PolymeraseChainReaction：聚合酶链式反应)，则甲基化胞嘧啶仍保持为胞嘧啶，但非甲基化胞嘧啶被从尿嘧啶替换成胸腺嘧啶而扩增。利用该PCR扩增产物在序列中产生的胞嘧啶和胸腺嘧啶这样的碱基的差异来分析甲基化状态。以此为基本原理通用的方法有专利文献1、非专利文献5中记载的Methylation－SpecificPCR(MSP)法、以及非专利文献6、7中记载的CombinedBisulfiteRestrictionAnalysis(COBRA)法。MSP法和COBRA法从无需特别的装置就能够进行甲基化DNA的定量分析这点来看现在仍是广泛使用的甲基化DNA分析方法，但从在分析中利用电泳法这点来看存在耗费精力和时间这样的课题。作为其它的甲基化DNA分析方法，有焦磷酸测序。在该方法中，将经亚硫酸氢盐处理过的DNA的PCR扩增产物供于焦磷酸测序，检测替换成胸腺嘧啶的甲基化胞嘧啶。但是，存在以下课题：焦磷酸测序需要专用的测序仪，另外由于是逐个读取碱基的方法，所以分析花费时间。最近，提出了通过将经亚硫酸氢盐处理过的DNA的PCR扩增产物供于离子交换色谱，基于该色谱的检测信号的保留时间判定DNA的甲基化率的方法(专利文献2)。该方法与以往的利用电泳、焦磷酸测序的甲基化DNA分析方法相比，具有分析的时间大幅缩短的优点。肾细胞癌(RenalCellCarcinoma：RCC)常发生于劳动人口的壮年期，大部分是通过肾摘除手术根治的病例组，但相反地，也明显存在迅速远处转移(distantmetastasis)的病例组，两者的临床经过有很大差异。此外，已知即便转移也有免疫疗法·分子靶向治疗药等成功的病例。复发可能性高的病例如果经过密切观察而早期诊断复发，并追加后续疗法，则有可能改善预后。但是，接触过虽然属于病理组织学上为低异型性且为最常见的组织型的透明细胞型RCC但发生迅速远处转移的病例，难以利用现有的临床病理学因素等进行预后预测。通过利用了MSP法、COBRA法、以及基于细菌人工染色体(BAC)阵列的甲基化CpG岛扩增法(BAMCA法)的分析，指出了从RCC患者得到的非癌肾皮质组织已经处于伴有DNA甲基化状态的变化的癌前病变阶段(专利文献3以及非专利文献8～11)。并且，通过基于BAMCA法的全基因组分析，明确了处于癌前病变阶段的非癌肾皮质组织的DNA甲基化的变化来自相同患者的对应的RCC，另外基于该方法成功研究出预测RCC病例的预后的方法(专利文献3和非专利文献10)。最近，明确了恶性程度高的RCC显示CIMP阳性表型，并且FAM150A、GRM6、ZNF540、ZFP42、ZNF154、RIMS4、PCDHAC1、KHDRBS2、ASCL2、KCNQ1、PRAC、WNT3A、TRH、FAM78A、ZNF671、SLC13A5以及NKX6－2这17个基因的CpG位点的甲基化是RCC的CIMP的特征(专利文献4)。在专利文献4中，提出了利用微珠阵列法、质量分析(MassARRAY法)、焦磷酸测序、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析、定量PCR、亚硫酸氢盐处理物的直接测序、COBRA法等，检测上述17个基因的CpG位点的甲基化水平，基于该甲基化水平进行聚类分析，由此检测RCC的预后不良风险的方法。现有技术文献专利文献专利文献1:美国专利第5786146号公报专利文献2:国际公开公报第2014/136930号公报专利文献3:日本特开2010－63413号公报专利文献4:国际公开公报第2013/168644号非专利文献非专利文献1:Nat.Rev.Cancer，4，988－993(2004)非专利文献2:Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，8681－8686(1999)非专利文献3:Proc.Natl.Acad.Sci.USA，104，18654－18659(2007)非专利文献4:CancerRes.，59，5438－5442(1999)非专利文献5:Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，9821－9826(1996)非专利文献6:NucleicAcidsRes.，24，5058－5059(1996)非专利文献7:NucleicAcidsRes.，25，2532－2534(1997)非专利文献8:Clin.CancerRes.，14，5531－5539(2008)非专利文献9:Int.J.Cancer，119，288－296(2006)非专利文献10:Carcinogenesis，30，214－221(2009)非专利文献11:Pathobiology，78，1－9(2011)
技术实现思路
为了防止癌的复发，希望通过获得基因组DNA的甲基化状态的信息，由此特异性高地判定复发风险并开始治疗。如果能够预测癌的转移·复发并在早期发现，则对其可期待免疫疗法、分子靶向治疗药等的奏效，因此需要一种能够更准确进行癌预后诊断的方法。并且，需要一种用于准确癌预后诊断的迅速且简便的方法。本专利技术人等发现：将经亚硫酸氢盐处理过的DNA的PCR扩增产物供于离子交换色谱而得到的信号对于CIMP阳性癌组和CIMP阴性癌组而言是不同的；通过分析该信号的微分值，能够更准确地辨别CIMP阳性癌组与CIMP阴性癌组之间的信号的差异，结果，能够更准确地进行癌的预后判定。因此，本专利技术提供以下内容。〔1〕一种含有肾细胞癌的组织的判定方法，包括以下工序：(1)将样品DNA供于离子交换色谱的工序，该样品DNA是用亚硫酸氢盐处理由受检者的肾脏组织制备的靶基因组DNA后进行PCR扩增而得到的；(2)算出该色谱的检测信号的微分值的工序；(3)工序(2)中算出的微分值具有2个以上的极大值的情况下，将该肾脏组织判定为预后不良的含有肾细胞癌的组织的工序。〔2〕根据〔1〕所述的方法，其中，上述靶基因组DNA含有选自FAM150A、GRM6、ZNF540、ZFP42、ZNF154、RIMS4、PCDHAC1、KHDRBS2、ASCL2、KCNQ1、PRAC、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有肾细胞癌的组织的判定方法，包括以下工序：(1)将样品DNA供于离子交换色谱的工序，该样品DNA是用亚硫酸氢盐处理由受检者的肾脏组织制备的靶基因组DNA后进行PCR扩增而得到的；(2)算出该色谱的检测信号的微分值的工序；(3)工序(2)中算出的微分值具有2个以上的极大值的情况下，将该肾脏组织判定为预后不良的含有肾细胞癌的组织的工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.02 JP 2015-1733111.一种含有肾细胞癌的组织的判定方法，包括以下工序：(1)将样品DNA供于离子交换色谱的工序，该样品DNA是用亚硫酸氢盐处理由受检者的肾脏组织制备的靶基因组DNA后进行PCR扩增而得到的；(2)算出该色谱的检测信号的微分值的工序；(3)工序(2)中算出的微分值具有2个以上的极大值的情况下，将该肾脏组织判定为预后不良的含有肾细胞癌的组织的工序。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述靶基因组DNA含有选自FAM150A、GRM6、ZNF540、ZFP42、ZNF154、RIMS4、PCDHAC1、KHDRBS2、ASCL2、KCNQ1、PRAC、WNT3A、TRH、FAM78A、ZNF671、SLC13A5以及NKX6－2中的至少一个基因中的CpG岛。3.一种肾细胞癌患者的预后判定方法，包括以下工序：(1)将样品DNA供于离子交换色谱的工序，该样品DNA是用亚硫酸氢盐处理由受检者的肾脏组织制备的靶基因组DNA后进行PCR扩增而得到的；(2)算出该色谱的检测信号的微分值的工序；(3)工序(2)中算出的微分值具有2个以上的极大值的情况下，...

【专利技术属性】
技术研发人员：金井弥荣，新井惠吏，根本有理子，与谷卓也，
申请(专利权)人：国立研究开发法人国立癌研究中心，积水医疗株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP