GITRL融合蛋白及其用途制造技术

本披露提供包括IgG Fc结构域、三聚结构域、和GITR配体的受体结合结构域的GITRL融合多肽亚基，其中这些融合多肽亚基可自组装成六聚体蛋白。还提供制造融合多肽亚基和六聚体蛋白的方法，以及例如用于治疗癌症的方法。

GITRL fusion protein and its use

This disclosure provides a subunit of GITRL fusion peptide containing the receptor binding domain of the IgG domain, the trimeric domain, and the GITR ligand, in which the fusion peptide subunits can be self assembled into six polymer proteins. Methods for producing fusion peptide subunits and six mer proteins are also provided, as well as methods for the treatment of cancer.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】GITRL融合蛋白及其用途对以电子方式提交的序列表的引用与本申请一起提交的ASCII文本文件的以电子方式提交的序列表内容(名称：GITRLF-100P2_ST25.txt；大小：56,159字节；以及创建日期：2016年6月15日)通过引用以其全部内容结合在此。
技术介绍
糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(TNFR)相关蛋白(GITR)，也称为TNFRSF18、AITR或CD357，是在调节性T细胞上表达，并在抗原处理的CD4+辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞以及活化的NK细胞上上调(Stephens等人J.Immunol.[免疫学杂志](2004)173(8):5008-5020；Clothier和Watts,CytokineGrowthFactorRev.[细胞因子生长因子评论](2014))。GITR是涉及通过抗原暴露控制T-细胞活化的受体和配体的复杂系统的一部分。GITR具有一个已知的内源性配体，GITR配体(GITRL)，该GITR配体以松散三聚体的形式存在，并且可以使GITR聚集，在T细胞内导致有效的细胞信号传导事件(Chattopadhyay等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]104(49):19452-19457)。GITR和GITRL之间的相互作用导致向T细胞递送正共刺激信号，这通过抗原暴露增强其增殖和活化，帮助促进记忆细胞产生并重编程调节性T细胞；降低其抑制功能(Clothier和Watts,CytokineGrowthFactorRev.[细胞因子生长因子评论](2014)1月4日；Schaer等人CurrOpinImmunol.[当前免疫学观点](2012))。
技术实现思路
本披露涉及多肽亚基，每一个作为融合多肽都包括GITR配体(GITRL)的受体结合结构域、多聚结构域(例如三聚结构域)和IgGFc结构域，这些多肽亚基能够形成稳定的多聚体(例如，六聚体蛋白)。提供了可用于癌症免疫疗法和病毒感染治疗的组合物和方法。在某些方面中，提供了分离的单链多肽亚基，其包括：IgGFc结构域；功能性多聚结构域；和糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)的受体结合结构域，其中该多肽亚基可以自组装成三聚体或六聚体蛋白。在某些方面中，提供了包括三个单链多肽亚基的三聚体蛋白，每一个单链多肽亚基包括：IgGFc结构域；功能性多聚结构域；和糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)的受体结合结构域。在某些方面中，提供了包括六个单链多肽亚基的六聚体蛋白，每一个单链多肽亚基包括：IgGFc结构域；功能性多聚结构域；和糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)的受体结合结构域。在某些方面中，提供了包括六聚体蛋白和载体的组合物。在某些方面中，提供了包括编码单链多肽亚基或六聚体蛋白的核酸的多核苷酸。在某些方面中，提供了包括编码单链多肽亚基或六聚体蛋白的多核苷酸的载体。在某些方面中，提供了包括编码单链多肽亚基或六聚体蛋白的多核苷酸的宿主细胞或包括包含这些多核苷酸的载体的宿主细胞。在某些方面中，提供了产生多肽亚基或产生六聚体蛋白的方法，其中这些方法包括：在如下条件下培养包括编码这些多肽亚基或六聚体蛋白的多核苷酸或载体的宿主细胞，在这些条件中由该多核苷酸或载体编码的多肽亚基或六聚体蛋白得以表达；并回收多肽亚基或六聚体蛋白。在某些方面中，提供了用以促进抗原处理的T细胞和/或活化的NK细胞的存活或增殖的方法，其中这些方法包括使抗原处理的T细胞和/或活化的NK细胞与该六聚体蛋白或组合物接触，其中该六聚体蛋白可以特异性地结合T细胞和/或NK细胞表面上的GITR。在某些方面中，提供了诱导细胞因子从活化的表达GITR的免疫细胞释放的方法，其中这些方法包括使这些细胞与该六聚体蛋白或组合物接触，其中该六聚体蛋白可以特异性地结合这些细胞表面上的GITR。在某些方面中，提供了促进T细胞或NK细胞活化的方法，其中这些方法包括使T细胞或NK细胞与该六聚体蛋白或组合物接触，其中该六聚体蛋白可以特异性地结合T细胞或NK细胞表面上的GITR。在某些方面中，提供了治疗受试者的癌症的方法，其中这些方法包括向需要治疗的受试者给予有效量的六聚体蛋白或组合物。在某些方面中，提供了增强受试者的免疫应答的方法，其中这些方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的六聚体蛋白或组合物。在某些方面中，提供了治疗受试者的实体瘤的方法，包括向受试者给予以上披露的分离的单链多肽亚基和OX40激动剂。另一方面中，提供了治疗受试者的实体瘤的方法，包括向受试者给予以上披露的分离的单链多肽亚基和T-细胞引发剂。附图说明图1.使用蛋白G和尺寸排阻色谱法纯化的重组GITRL融合蛋白(FP)(母系蛋白1wt)和GITRLFP(冠蛋白1awt)蛋白的SDS-PAGE分析。图2A-D.显示六聚体GITRLFP变体与表达GITR的CHO细胞的结合特征曲线的图表。图3A-D.显示与三聚体GITRL竞争结合GITR-Fc的六聚体GITRLFP变体的抑制特征曲线的图表。图4A-D.显示使用人GITR转染的NF-κB荧光素酶基因报告细胞系，GITRLFP分子的相对效力的图表。图5A-D.GITRLFP(GCN4pII)、GITRLFP(冠蛋白1awt)、GITRLFP(朗格汉斯蛋白wt)和GITRLFP(朗格汉斯蛋白变体)的去折叠转变。图6.洗脱的峰的摩尔质量组成。该图表显示溶液中的多聚体GITRLFP母系蛋白-1蛋白(虚线)形成重均摩尔质量(从左到右)为612、312和215kDa的三种物质，其中没有容易鉴别的主要种类。另一方面，>90％的多聚体GITRLFP(冠蛋白1awt；虚线)和多聚体GITRLFP(GCN4pII；实线)蛋白质量洗脱为单一蛋白种类。这些峰虽然不是完全单分散的，但最可能是由于附接至蛋白质上的聚糖的异质性。图7.六聚体GITRLFP分子的示意图。图8.代表性GITRLIgG1融合多肽亚基的核苷酸和经翻译的蛋白质序列。各结构域被突出显示并注释。ECD＝胞外结构域；GITRL＝糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体；HA＝血凝素。图8的核酸序列提供为SEQIDNO:7，并且编码的前体蛋白质序列提供为SEQIDNO:8。图9.针对还原的GITRLIgG1FP亚基的解卷积LC-QTOFMS谱。如通过与四极杆飞行时间(QTOF)质谱法(LC-QTOFMS)偶联的液相色谱法测定的，GITRLIgG1FP单体亚基(SEQIDNO:6)的精确质量与在Fc结构域中的典范糖基化位点处每个链加入一个双触角聚糖(主要为G0f)的预期氨基酸序列一致。图10.在均相时间分辨荧光测定中，与铕穴状化合物轭合的人GITR-Fc与hGITRL-HA结合。IgG1同种型对照抗体的滴定不抑制此结合。包括具有在SEQIDNO:6中列出的氨基酸序列的单体亚基的六聚体GITRLIgG1FP以0.562nM的半最大抑制浓度(IC50)抑制hGITR和hGITRL之间的结合。实验在一式两份的孔中进行。误差条代表均值的标准误差。GITR(L)＝糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(配体)。图11.六聚体GITRLFP是GITR受体的有效激动剂。将测试品在溶液中以指本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的单链多肽亚基，包括：IgG Fc结构域；功能性多聚结构域；和糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)的受体结合结构域，其中该多肽亚基可以自组装成三聚体或六聚体蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.12 US 62/204212;2016.06.15 US 62/3504471.一种分离的单链多肽亚基，包括：IgGFc结构域；功能性多聚结构域；和糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)的受体结合结构域，其中该多肽亚基可以自组装成三聚体或六聚体蛋白。2.如权利要求1所述的多肽亚基，其中该多聚结构域是三聚结构域。3.如权利要求1或2所述的多肽亚基，该多肽亚基从氨基末端到羧基末端包括该IgGFc结构域，随后是该多聚或三聚结构域，随后是该GITRL受体结合结构域。4.如权利要求1至3中任一项所述的多肽亚基，其中该IgGFc结构域的羧基末端经由第一接头区与该多聚或三聚结构域的氨基末端融合。5.如权利要求1至4中任一项所述的多肽亚基，其中该多聚或三聚结构域的羧基末端经由第二接头区与该GITRL受体结合结构域的氨基末端融合。6.如权利要求1至4中任一项所述的多肽亚基，其中该IgGFc结构域的羧基末端直接与该多聚或三聚结构域的氨基末端融合。7.如权利要求5或6所述的多肽亚基，其中该IgGFc结构域在其氨基末端包括IgG铰链区。8.如权利要求5或6所述的多肽亚基，其中该IgG铰链区包括赋予完整的重链间二硫键形成的突变。9.如权利要求7或8所述的多肽亚基，其中该IgG铰链区包括IgG1铰链区、IgG4铰链区或其变体。10.如权利要求9所述的多肽亚基，其中该IgG4铰链区具有根据EU编号(IgG4P)的在位置228处的丝氨酸至脯氨酸突变(S228P)。11.如权利要求1至10中任一项所述的多肽亚基，其中该IgGFc结构域是人IgGFc结构域。12.如权利要求1至4或6至10中任一项所述的多肽亚基，其中该多聚或三聚结构域的羧基末端直接与该GITRL受体结合结构域的氨基末端融合。13.如权利要求5至12中任一项所述的多肽亚基，其中当存在时，该第一接头区、该第二接头区、或者该第一接头区和该第二接头区独立地选自下组，该组由以下各项组成：包含(Gly4)n基序、(Gly4Ser)n基序(SEQIDNO:19)、Ser(Gly4Ser)n基序(SEQIDNO:22)、GGGGSGGGGSGGGGSAL(SEQIDNO:23)、GGGGSGGGGSGGGGSA(SEQIDNO:24)及其组合的接头区，其中n是选自下组的正整数，该组由以下各项组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。14.如权利要求13所述的多肽亚基，其中该第一接头区和该第二接头区独立地选自下组，该组由以下各项组成：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO:25)和GGGGSGGGGSGGGG(SEQIDNO:26)。15.如权利要求13或权利要求14所述的多肽亚基，其中该第一接头区是GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO:20)，并且该第二接头区是(Gly4)基序。16.如权利要求1至15中任一项所述的多肽亚基，其中该IgGFc结构域包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IG4PFc结构域或其变体。17.如权利要求1至16中任一项所述的多肽亚基，其中该IgGFc结构域含有选自下组的一个或多个氨基酸残基取代，该组由以下各项组成：252Y、254T、256E及其组合，其中这些残基是根据EU编号进行编号。18.如权利要求1至17中任一项所述的多肽亚基，其中该IgGFc结构域包含CH2区。19.如权利要求18所述的多肽亚基，其中该IgGFc结构域进一步包含CH3区。20.如权利要求19所述的多肽亚基，其中该IgGFc结构域包含与SEQIDNO:21具有至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％序列一致性的氨基酸序列。21.如权利要求19所述的多肽亚基，其中该IgGFc结构域包括SEQIDNO:21的氨基酸序列。22.如权利要求1至21中任一项所述的多肽亚基，其中该三聚结构域包括α-螺旋卷曲螺旋结构域、亮氨酸拉链结构域、或它们的组合。23.如权利要求22所述的多肽亚基，其中该三聚结构域源自于母系蛋白1、冠蛋白1a、营养不良性肌强直激酶(DMPK)、朗格汉斯蛋白或其组合。24.如权利要求23所述的多肽亚基，其中该三聚结构域源自于母系蛋白1或冠蛋白1a。25.如权利要求24所述的多肽亚基，其中该三聚结构域源自于冠蛋白1a。26.如权利要求25所述的多肽亚基，其中该三聚结构域包括与SEQIDNO:11具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列一致性的冠蛋白1a三聚结构域。27.如权利要求26所述的多肽亚基，其中该冠蛋白1a三聚结构域包括SEQIDNO:11的氨基酸序列。28.如权利要求26所述的多肽亚基，其中该三聚结构域包括SEQIDNO:10的冠蛋白1a三聚结构域。29.如权利要求26所述的多肽亚基，其中该冠蛋白1a三聚结构域包括SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18的氨基酸序列或其任何组合或变体。30.如权利要求24所述的多肽亚基，其中该三聚结构域包括与SEQIDNO:28具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列一致性的母系蛋白1三聚结构域。31.如权利要求23所述的多肽亚基，其中该三聚结构域包括与SEQIDNO:30具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列一致性的DMPK三聚结构域。32.如权利要求23所述的多肽亚基，其中该三聚结构域包括与SEQIDNO:32具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列一致性的朗格汉斯蛋白三聚结构域。33.如权利要求23所述的多肽亚基，其中该三聚结构域包括SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32或SEQIDNO:33的氨基酸序列。34.如权利要求1至33中任一项所述的多肽亚基，其中该GITRL受体结合结构域包括与SEQIDNO:34具有至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％序列一致性的氨基酸序列。35.如权利要求1至33中任一项所述的多肽亚基，其中该GITRL受体结合结构域包括与SEQIDNO:37具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％序列一致性的氨基酸序列，其中残基161不是天冬酰胺酰残基。36.如权利要求35所述的多肽亚基，其中该GITRL受体结合结构域包括SEQIDNO:35的氨基酸序列。37.如权利要求1至33中任一项所述的多肽亚基，其中该GITRL受体结合结构域包括SEQIDNO:35的氨基酸序列，其中残基161是天冬氨酰残基。38.如权利要求37所述的多肽亚基，其中该GITRL受体结合结构域包括SEQIDNO:36的氨基酸序列。39.如权利要求38所述的多肽亚基，其中该GITRL受体结合结构域包括SEQIDNO:37的氨基酸序列。40.如权利要求1至39中任一项所述的多肽亚基，其中从六个该多肽亚基组装的六聚体蛋白可特异性地结合至人GITR。41.如权利要求1至40中任一项所述的多肽亚基，其中该蛋白质是非糖基化的。42.如权利要求1至41中任一项所述的多肽亚基，包括与SEQIDNO:6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。43.如权利要求42所述的多肽亚基，包括SEQIDNO:6的氨基酸序列。44.如权利要求1至43中任一项所述的多肽亚基，其中该亚基具有激动剂活性。45.如权利要求1至44中任一项所述的多肽亚基，进一步包括相关联的异源剂。46.如权利要求45所述的多肽亚基，其中该异源剂是异源多肽并经由肽键融合到该多肽亚基。47.如权利要求46所述的多肽亚基，其中该异源多肽融合至该IgG-Fc结构域的N-末端、融合至GITRL的该受体结合结构域的C末端、融合至该IgG-Fc结构域的C-末端和该三聚结构域的N-末端，或融合至该三聚结构域的C-末端和GITRL的该受体结合结构域的N-末端。48.如权利要求45所述的多肽亚基，其中该异源剂以化学方式轭合至该多肽亚基。49.如权利要求45至48中任一项所述的多肽亚基，其中该异源剂包括细胞毒性分子、稳定剂、免疫应答调节剂、或可检测的药剂。50.一种三聚体蛋白，包括三个如权利要求1至49中任一项所述的多肽亚基。51.一种六聚体蛋白，包括六个如权利要求1至49中任一项所述的多肽亚基。52.如权利要求51所述的六聚体蛋白，其可以特异性地结合在CD4+或CD8+T细胞、B细胞或NK细胞上表达的糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)，其中这些CD4+或CD8+T细胞或B细胞任选地是抗原处理的或这些NK细胞任选地是活化的，这些细胞来自人或非人灵长类动物，任选地食蟹猴、恒河猴，或其任何组合。53.如权利要求52所述的六聚体蛋白，该六聚体蛋白可特异性地结合在来自人，或非人灵长类动物，任选地食蟹猴、恒河猴，或其任何组合的初级CD4+或CD8+T细胞上表达的GITR。54.如权利要求52或53中任一项所述的六聚体蛋白，其中这些CD4+或CD8+T细胞是抗原处理的。55.如权利要求51或权利要求54所述的六聚体蛋白，其中如通过动力学排除测定测量的，对人GITR的结合亲和力是约54nM至约111nM。56.如权利要求55所述的六聚体蛋白，其中如在动力学排除测定(KinExA)中测量的，该结合亲和力是约82nM。57.如权利要求51至56中任一项所述的六聚体蛋白，其可诱导剂量依赖性增殖和自GITR阳性免疫细胞的剂量依赖性细胞因子释放。58.如权利要求57所述的六聚体蛋白，其中这些GITR阳性免疫细胞是基于板的测定中的T细胞。59.如权利要求52至58中任一项所述的六聚体蛋白，其中这些细胞是CD4+、CD8+、NK、或B细胞。60.如权利要求57至59中任一项所述的六聚体蛋白，其中这些GITR阳性免疫细胞、T细胞、CD4+、CD8+或B细胞是抗原处理的和/或NK细胞是活化的。61.如权利要求60所述的六聚体蛋白，如通过胸苷掺入测量的，该六聚体蛋白可刺激抗原处理的初级人T细胞的增殖，EC50是约0.1至约2.7nM。62.如权利要求61所述的六聚体蛋白，其中该EC50是约0.5nM。63.如权利要求57所述的六聚体蛋白，其中该细胞因子是IFNγ、TNFα、IL-5、IL-10、IL-2、IL-4、IL-13、IL-8、IL-12p70、IL-1β、或其任何组合。64.如权利要求51至63中任一项所述的六聚体蛋白，其可以活化表达GITR的细胞中的下游信号传导途径，任选地，其中该下游信号传导途径是NFκB途径或MAPK途径。65.如权利要求64所述的六聚体蛋白，其中这些表达GITR的细胞是T细胞。66.如权利要求64所述的六聚体蛋白，其中这些表达GITR的T细胞是表达GITR的JurkatNFκB-荧光素酶报告细胞，该JurkatNFκB-荧光素酶报告细胞响应于NFκB信号传导途径的刺激产生荧光素酶。67.如权利要求51至66中任一项所述的六聚体蛋白，其中向需要癌症治疗的受试者给予有效剂量可抑制该受试者中的肿瘤生长。68.如权利要求67所述的六聚体蛋白，其中该肿瘤生长抑制是在GITR阳性免疫细胞任选地T-细胞或NK细胞的存在下实现的。69.如权利要求67或68所述的六聚体蛋白，其中与给予同种型匹配的对照相比，肿瘤生长被抑制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少100％。70.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：RA斯图尔特，NJ蒂格，LL杨，DR希加兹，L班伯，S斯里哈兰，R莱兰，NM杜伦，
申请(专利权)人：免疫医疗有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB