经半胱氨酸取代的免疫球蛋白制造技术

本公开提供了经半胱氨酸取代的免疫球蛋白，包括多肽、抗体、编码此类多肽和抗体的核酸，用于制备其的宿主细胞、载体和方法，抗体的经缀合的衍生物，制备此类抗体和经缀合的衍生物的组合物和方法，及使用抗体和经缀合的变体用于检测和治疗癌症以及用于杀伤患病细胞的方法。在某些实施方案中，该取代选自重链中的V266C、G316C、H285C、R301C、V303C、T307C、Y436C和L441C(EU编号)或S156(根据Kabat编号)。

Cysteine substituted immunoglobulins

The present disclosure provides a cysteine substituted immunoglobulin, including peptides, antibodies, nucleic acids encoding such peptides and antibodies, for preparation of their host cells, carriers and methods, conjugated derivatives of antibodies, preparation of such antibodies and combinations and methods of conjugated derivatives, and the use of antibodies and affixes. The variants are used for the detection and treatment of cancer and for the killing of sick cells. In some implementations, the replacement is selected from V266C, G316C, H285C, R301C, V303C, T307C, Y436C, and L441C (EU number) or S156 (according to Kabat number) in the heavy chain.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经半胱氨酸取代的免疫球蛋白相关申请的交叉引用本专利申请要求2015年7月16日提交的美国临时专利申请第62/193,531号的优先权权益，其出于所有目的通过引用并入本文。以文本文件提交的序列表的引用序列表写于2016年7月15日创建的文件1014170_ST25.txt，其为10,366字节，机器形式IBM-PC，MS-Windows操作系统，出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
技术介绍
单克隆抗体(mAb)由于它们对靶抗原的高特异性和亲和力而在研究和疗法中是必不可少的工具。自二十世纪九十年代以来，治疗性mAb已经对包括炎性病症和癌症的各种疾病的医疗保健产生重大影响。mAb的一个关键特征是其以高度特异性的方式结合靶抗原，将其标记以通过宿主免疫清除法(诸如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))去除的能力。还可通过结合靶抗原并抑制其功能来赋予抗体治疗性益处，如在曲妥珠单抗(Herceptin)、贝伐珠单抗和西妥昔单抗的情况下。CLL-1是一种主要在血液恶性肿瘤，诸如白血病(如急性髓性白血病(AML))中存在的髓性细胞中表达的细胞表面糖蛋白。目前可用的血液恶性肿瘤疗法有不良且往往是严重的副作用。例如，由施用引起的并发症包括肝毒性、静脉闭塞性疾病、严重骨髓抑制(在-98％患者中)、肿瘤溶解综合征、免疫超敏性综合征及呼吸病症。因此，需要鉴定有效且副作用降低的新型血液恶性肿瘤疗法。由于CLL-1在髓性细胞上选择性表达，识别并结合CLL-1的组合物可用于此类血液恶性肿瘤，尤其是骨髓来源的血液恶性肿瘤的疗法。与细胞毒性药物或放射性核素缀合可以扩大mAb的效用并改善其效力和有效性。这是因为抗体特异性地靶向并递送细胞毒性有效载荷至患病组织而实现的。抗体已通过多种接头化合物缀合至多种细胞毒性药物，且这些抗体药物缀合物(ADC)具有选择性且有效地杀灭抗原-表达性肿瘤细胞的能力。ADC经证实已在临床上取得成功，且有两种此类药物，ado-曲妥珠单抗美坦新(ado-trastuzumabemtansine)和布仑妥昔单抗维汀(brentuximabvendotin)可商购获得。ADC的成功开发取决于对抗体选择性、接头稳定性、细胞毒性药物效力以及接头-药物缀合至抗体的模式的优化。在常规ADC中，药物缀合产生异质性产物，其含有具有不同药物与抗体摩尔比的种类的混合物。抗体的缀合位点存在于溶剂可及的反应性氨基酸残基诸如赖氨酸或半胱氨酸处。异质性以两个水平存在，因为每个ADC种类在药物载量和缀合位点上都不同。Panowski等人,mAbs6:1,31-45(2014)。因此，每个种类可能具有不同的性质，导致广泛的体内药代动力学(PK)性质以及批次间变异。此外，可变的药物与抗体比(DAR)导致高药物载量、高疏水性、快速清除、较低的耐受性和狭窄的治疗窗口。Junutula等人,Nat.Biotech.26(8),925-932(2008)。位点-特异性缀合(其中已知数量的接头-药物始终缀合至确定的位点)是克服这些挑战的一种方式。异质性被最小化，并且ADC性质更具可预测性，产生批次间一致的缀合物。氨基酸半胱氨酸提供反应性硫醇基团。该基团长久以来一直被用作定位以标记蛋白以及用于产生ADC。虽然半胱氨酸可以工程化成蛋白，但这种方法并非没有挑战。例如，经工程化的游离半胱氨酸可与其它分子上的半胱氨酸共轭以形成蛋白-二聚体。它也可以与天然半胱氨酸残基分子内配对以产生不适当的折叠而损害或抑制蛋白功能。因此，成功使用引入的半胱氨酸残基作为位点-特异性缀合是依赖于选择合适位点的能力，其中引入半胱氨酸的取代不改变抗体结构或功能。Junutula等人,Nat.Biotech.30(2):184-191(2012)。另一个复杂之处是取代位点处的溶剂可及性和电荷对于ADC稳定性是重要的。在经半胱氨酸工程化的抗-Her2/neu马来酰亚胺接头ADC的稳定性研究中，高溶剂可及性由于马来酰亚胺与白蛋白中的反应性硫醇、游离半胱氨酸或谷胱甘肽的交换而丧失血浆中的缀合的硫醇-反应性接头。Shen等人,Nat.Biotech.30(2):184-191(2012)。因此，仍然有很大需求来鉴定具有一致的药物载量、低疏水性、缓慢清除、高耐受性和较好的治疗指数的稳定的位点特异性ADC。此外，甚至还更需要创造靶向CLL-1的稳定的位点特异性ADC。本背景中的陈述既不是对现有技术的承认，也不是对所引用参考文献的认可。专利技术概述本公开提供了经半胱氨酸取代的免疫球蛋白，其包括多肽、抗体、编码此类多肽和抗体的核酸，用于制备其的宿主细胞、载体和方法，抗体的经缀合的衍生物，制备此类抗体和经缀合的衍生物的组合物和方法，以及使用抗体和经缀合的变体检测和治疗癌症以及杀灭患病细胞的方法。在一个实施方案中，本公开提供了经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽，其中经取代的残基选自如下的一种或多种残基：V266C、H285C、R301C、V303C、T307C、G316C、Y436C和L441C(EU编号)。在一方面，免疫球蛋白多肽源自人IgG重链恒定区。在另一方面，IgG是同种型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在另一个实施方案中，本公开提供了编码经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽的分离的核酸序列，其中经取代的残基选自如下的一种或多种残基：V266C、H285C、R301C、V303C、T307C、G316C、Y436C和L441C(EU编号)。在一方面，核酸与表达控制序列可操作地连接。在另一方面，可操作地连接的核酸进一步包含在表达载体中。在另一方面，本公开提供了包含表达载体的宿主细胞。在另一个实施方案中，本公开提供了用于制备经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽的方法，其包括培养包含核酸分子(还包括编码经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽的核苷酸序列)的重组细胞，其中经取代的残基选自如下的一种或多种残基：V266C、H285C、R301C、V303C、T307C、G316C、Y436C和L441C(EU编号)。在另一个实施方案中，本公开提供了经半胱氨酸取代的抗体，所述抗体包含经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽，所述多肽进一步包含选自如下的经取代的氨基酸残基：重链恒定区中的V266C、H285C、R301C、V303C、T307C、G316C、Y436C和L441C(EU编号)。在一方面，重链恒定区源自人IgG同种型，所述人IgG同种型选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在另一方面，抗体还包含轻链。在另一方面，轻链选自κ和λ。在另一方面，抗体能结合CLL-1、GPR114、IL1RAP、TIM-3、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33、CD123/IL3Ra、c-Met、PSMA、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、CEA、CA-125、Muc-1、AFP、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、酪氨酸酶、TRPI/gp75、gp100/pmel-17、Melan-A/MART-1、Her2/neu、WT1、EphA3、端粒酶、HPVE6、HPVE7、EBNA1、BAGE、GAGE和MAGEA3TCRSLITRK6、ENPP3、连接蛋白-4、CD2本文档来自技高网...

【技术保护点】
经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽，其包含选自以下的经取代的氨基酸残基：根据EU编号的V266C、G316C、H285C、R301C、V303C、T307C、Y436C和L441C。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.16 US 62/193,5311.经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽，其包含选自以下的经取代的氨基酸残基：根据EU编号的V266C、G316C、H285C、R301C、V303C、T307C、Y436C和L441C。2.如权利要求1所述的多肽，其中所述免疫球蛋白多肽源自人IgG重链恒定区。3.如权利要求2所述的多肽，其中所述IgG是选自以下的同种型：IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。4.如权利要求3所述的多肽，其中所述同种型是IgG1。5.核酸分子，其包含编码半胱氨酸取代物的核苷酸序列。6.免疫球蛋白多肽，其包含选自以下的经取代的氨基酸残基：根据EU编号的V266C、G316C、H285C、R301C、V303C、T307C、Y436C和L441C。7.如权利要求5所述的核酸分子，其还包含与所述核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。8.如权利要求6所述的核酸分子，其包含在表达载体中。9.重组细胞，其包含含有编码经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽包含选自以下的经取代的氨基酸残基：根据EU编号的V266C、G316C、H285C、R301C、V303C、T307C、Y436C和L441C。10.用于制备经半胱氨酸取代的多肽的方法，其包括培养含有核酸分子的重组细胞，所述核酸分子包含编码经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽的核苷酸序列，所述经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽包含选自以下的经取代的氨基酸残基：根据EU编号的V266C、G316C、H285C、R301C、V303C、T307C、Y436C和L441C。11.经半胱氨酸取代的抗体，其包含含有选自以下的经取代的氨基酸残基的经半胱氨酸取代的免疫球蛋白多肽：根据EU编号的重链恒定区中的V266C、G316C、H285C、R301C、V303C、T307C、Y436C和L441C。12.如权利要求10所述的抗体，其中重链恒定区源自人IgG同种型，所述人IgG同种型选自：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。13.如权利要求10所述的抗体，其包含选自κ和λ的免疫球蛋白轻链。14.如权利要求12所述的抗体，其中轻链是κ。15.如权利要求10所述的抗体，其能结合CLL-1、GPR114、IL1RAP、TIM-3、CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33、CD123/IL3Ra、c-Met、PSMA、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、CEA、CA-125、Muc-1、AFP、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、酪氨酸酶、TRPI/gp75、gp100/pmel-17、Melan-A/MART-1、Her2/neu、WT1、EphA3、端粒酶、HPVE6、HPVE7、EBNA1、BAGE、GAGE和MAGEA3TCRSLITRK6、ENPP3、连接蛋白-4、CD27、SLC44A4、CAIX、Cripto、CD30、MUC16、GPNMB、BCMA、Trop-2、组织因子(TF)、CanAg、EGFR、αv-整联蛋白、CD37、叶酸受体、CD138、CEACAM5、CD56、CD70、CD74、GCC、5T4、CD79b、Steap1、Napi2b、LewisY抗原、LIV、c-RET、DLL3、EFNA4或内皮唾酸蛋白/CD248。16.如权利要求14所述的抗体，其包含可变轻链和可变重链，其中：(a)所述可变轻链包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，此外其中：CDR-L1是ESVDSYGNSF(SEQIDNO:1)CDR-L2是LAS(SEQIDNO:2)CDR-L3是QQNNYDPWT(SEQIDNO:3)，以及(b)所述可变重链包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，此外其中：CDR-H1是GYTFTSYV(SEQIDNO:4)CDR-H2是INPYNDGT(SEQIDNO:5)，和CDR-H3是ARPIYFDNDYFDY(SEQIDNO:6)；或其中：(c)所述可变轻链还包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，此外其中：CDR-L1是RATQELSGYLS(SEQIDNO:13)CDR-L2是AASTLDS(SEQIDNO:14)CDR-L3是LQYAIYPYT(SEQIDNO:15)，以及(d)所述可变重链还包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，此外其中：CDR-H1是GYTFTSYFIH(SEQIDNO:16)CDR-H2是FINPYNDGSK(SEQIDNO:17)，和CDR-H3是DDGYYGYAMDY(SEQIDNO:18)。17.核酸分子，其包含编码权利要求10-17所述的抗体的核苷酸序列。18.如权利要求17所述的核酸分子，其与表达控制序列可操作地连接。19.如权利要求18所述的核酸分子，其还包含表达载体。20.重组细胞，其包含权利要求19所述的核酸分子。21.用于制备抗体的方法，其包括培养权利要求1所述的重组细胞。22.如权利要求1所述的方法，其还包括分离所述抗体。23.抗体缀合物，其包含权利要求1-4或10-15中任一项所述的抗体，所述抗体由所述抗体中经取代的氨基酸残基(半胱氨酸)通过接头缀合至选自以下的部分：药物、放射性核苷酸、荧光团、生物素、RNA、抗生素、蛋白和可检测部分。24.如权利要求1所述的抗体缀合物，其缀合至药物。25.如权利要求1所述的抗体缀合物，其中所述药物选自：单体的或二聚体的苯二氮衍生物、类美登素、阿里他汀、多拉司他汀、小管素、念珠藻素、吡咯并苯二氮(PBD)二聚体、吲哚啉并苯二氮二聚体、异喹啉烷并苯二氮二聚体、α-鹅膏蕈碱、单端胞菌毒素、SN-38、倍癌霉素、CC1065、加利车霉素、烯二炔抗生素...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰格塔·R·祖奴图拉，蒋英萍，黄姜清，马德哈维·米什拉，
申请(专利权)人：塞勒兰特治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国,US