用于治疗脓毒症的半通道胞外域特异性药剂制造技术

本发明专利技术公开了治疗受试者中脓毒症或内毒素血症的方法，包括向受试者施用一定量的Panx1半通道蛋白拮抗剂或一定量的Cx43半通道蛋白拮抗剂。

Semi channel extracellular domain specific agents for treatment of sepsis

The present invention discloses a method for treating sepsis or endotoxemia in subjects, including the use of a certain amount of Panx1 semi channel protein antagonist or a certain amount of Cx43 semi channel protein antagonist to the subjects.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗脓毒症的半通道胞外域特异性药剂相关申请的交叉引用本申请要求于2015年8月6日提交的美国临时申请号62/201,759的权益，该申请的内容通过引用并入本文。专利技术背景在整个本申请中，各种专利和其他出版物在括号中以编号引用。参考文献的全部引用可以在说明书的最后找到。这些参考文献和本文提及的所有专利、专利申请公开和书籍的公开内容通过引用整体并入本申请，以更全面地描述本专利技术所属领域。细菌感染和脓毒症是重症监护病房中最常见的死亡原因，每年仅在美国就有＞225,000名受害者。脓毒症的发病机制仍然知之甚少，但可归因于先天性免疫细胞(IMC)对微生物感染反应所引起的系统性炎症反应失调(1，2)，并且部分原因可能是促炎性介质(如HMGB1、CIRP和NO)支持的炎症反应失调。HMGB1作为致死性系统性炎症(LSI)的晚期介体的开创性发现(Wang等人,Science,285:248-51,1999)已经促使研究HMGB1分泌的药理学调节的复杂机制。本专利技术致力于改善脓毒症药物治疗的需要，包括通过半通道活性调节HMGB1分泌。专利技术概述提供了治疗受试者中脓毒症或内毒素血症的方法或减少或抑制受试者中脓毒症发展的方法，所述方法包括向所述受试者施用足以治疗脓毒症或内毒素血症、或足以减少或抑制脓毒症的发展的一定量的Panx1半通道蛋白拮抗剂或一定量的Cx43半通道蛋白拮抗剂。还提供了治疗受试者中脓毒症或内毒素血症的方法或减少或抑制受试者中脓毒症发展的方法，所述方法包括向受试者施用足以治疗脓毒症或内毒素血症、或足以减少或抑制脓毒症的发展的一定量的Panx1半通道蛋白表达抑制剂或一定量的Cx43半通道蛋白表达抑制剂。提供了治疗受试者中缺血-再灌注损伤或减少或抑制受试者中缺血-再灌注损伤发展的方法，所述方法包括向所述受试者施用足以治疗受试者中缺血-再灌注损伤、或降低或抑制受试者中缺血-再灌注损伤的发展的一定量的Cx43半通道蛋白拮抗剂。从下面的描述中，本专利技术的其他目的将是显而易见的。附图简要说明图1.主要甘草成分及衍生物的化学结构。主要甘草成分甘草酸(GZA)可以在体内通过葡萄糖醛甘酸酶(glycaronidase)被水解成甘草次酸(glycyrrhitinicacid)(GTA或甘草次酸(enoxolone))。在体外，GTA可以被酯化成称为“甘珀酸(carbenoxolone)”(CBX)的琥珀酸酯。图2.CBX有效抑制LPS诱导的HMGB1分泌和NO产生。在不存在或存在CBX的情况下，用粗制LPS刺激原代腹腔巨噬细胞16小时，通过Western印迹、格里斯反应和ELISA分别测定细胞外HMGB1、NO和TNF的水平。AU，任意单位。*，与“仅+LPS”比较P<0.05。图3A-3B.CBX和oATP(一种P2X7R拮抗剂)减弱粗制LPS诱导的PKR磷酸化。在不存在或存在CBX(图3A)或oATP(图3B)的情况下，用粗制LPS刺激原代腹膜巨噬细胞16小时，通过Western印迹分析参照管家蛋白β-肌动蛋白测定总和磷酸化PKR(“P-PKR”)细胞水平。*，与“-LPS-CBX”比较P<0.05#，与“仅+LPS”比较P<0.05。图4.CBX的延迟施用拯救了小鼠免于致死性脓毒症。Balb/C小鼠经受致死性脓毒症(由CLP诱导)，并在CLP后+24、+48和+72h以指定剂量腹膜内施用盐水或CBX。监测动物存活率，并使用Kaplan-Meier方法比较组间差异。箭头表示药物施用的时间点。*，与盐水对照组比较P<0.05。图5A-5B.LPS和SAA在鼠巨噬细胞和人单核细胞中诱导Panx1表达。用粗制LPS或SAA刺激原代鼠腹膜巨噬细胞(图5A)和人外周血单核细胞(HuPBMC，图5B)6小时，并通过免疫细胞化学(图5A)和Western印迹分析(图5B)分别评估细胞Panx1水平。图6A-6B.Cx43-和Panx1-特异性肽拮抗剂不同地影响败血症致死率。图6A)使Balb/C小鼠经受CLP诱导的脓毒症，并在CLP后+6、+18和+36h腹膜内施用盐水或Cx43-或Panx1-特异性模拟肽(Gap26或10Panx；120mg/kg)。监测动物存活率，持续两周，并使用Kaplan-Meier方法比较组间差异。所显示的是具有相似结果的两个独立实验的总结。*，与盐水组比较P<0.05。图6B)Cx43的膜拓扑结构，指示三种模拟肽拮抗剂：Gap19、Gap26和Gap27的相对定位。图7.小Cx43肽拮抗剂的合成。合成对应于连接蛋白43(Cx43)的细胞外环1(EL1)的肽(下部的图显示的10个肽)。筛选这些肽在抑制巨噬细胞半通道活性和在感染或损伤引发的炎性疾病的动物模型中的保护效力中的活性。(P1是SEQIDNO：3；P2是SEQIDNO：4；P3是SEQIDNO：5；P4是SEQIDNO：6；P5是SEQIDNO：1；P6是SEQIDNO：2；P7是SEQIDNO：7；P8是SEQIDNO：8；P9是SEQIDNO：9；并且P10是SEQIDNO：10)。上部的图所示的CX43序列是SEQIDNO：11。CX43细胞外环1是SEQIDNO：12。具有已知为Gap26(SEQIDNO：13)的序列的CX43细胞外环1的部分是SEQIDNO：12的残基22至34。图8.P5肽(SEQIDNO：1)显著抑制细菌内毒素诱导的染料摄取。萤虫黄染料摄取被用来测量连接蛋白43门控的半通道活性。简而言之，在不存在或存在CBX或其他Cx43肽拮抗剂(GAP26(SEQIDNO：13)或P5)的情况下，用LPS刺激RAW264.7细胞16h。随后，将细胞培养物与萤虫黄(LY，1mg/ml)一起孵育15min，并用1×PBS三次充分洗涤后用2％多聚甲醛固定。在荧光显微镜下计数具有扩散的荧光信号的细胞的数量。包含点状(punctuate)荧光信号的细胞被排除，因为点状信号可能是由LY染料的吞噬(而不是通过Cx43半通道的被动扩散)造成的。图9.P5肽显著减弱致死性脓毒症。通过CLP使Balb/C小鼠(雄性，20-25g，7-10周)经受致死性脓毒症，并且在CLP后0.5、24小时腹膜内施用对照盐水(0.2ml/小鼠)或指定肽(10.0mg/kg)。评估动物存活，持续至多两周，并且使用Kaplan-Meier方法来比较组间死亡率的差异。P值<0.05被认为是统计学显著的。注意，肽#2、#3、#4、#8、#9和#10没有赋予针对致死性脓毒症的保护作用。然而，P5(SEQIDNO：1)强烈且显著增加了动物存活。在较小程度上，P6(SEQIDNO：2)在致死性脓毒症的动物模型中也显示出保护作用(数据未显示)。图10.静脉内施用Cx43肽拮抗剂赋予针对肝脏缺血/再灌注(I/R)损伤的保护作用。通过暂时夹住肝动脉和门静脉60分钟(这通常在70％的肝脏中产生缺血)使雄性C57BL/6小鼠(20-25g)经受肝缺血/再灌注。在再灌注开始时，通过颈内静脉注射0.2ml盐水、P5(ENVCYD；10.0mg/kgBW)或P5A(ENVSYD(SEQIDNO：14)；10.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗受试者中脓毒症或内毒素血症、或减少或抑制受试者中脓毒症发展的方法，所述方法包括向所述受试者施用足以治疗脓毒症或内毒素血症、或足以减少或抑制脓毒症的发展的一定量的Cx43半通道蛋白拮抗剂或一定量的Panx1半通道蛋白拮抗剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.06 US 62/201,7591.一种治疗受试者中脓毒症或内毒素血症、或减少或抑制受试者中脓毒症发展的方法，所述方法包括向所述受试者施用足以治疗脓毒症或内毒素血症、或足以减少或抑制脓毒症的发展的一定量的Cx43半通道蛋白拮抗剂或一定量的Panx1半通道蛋白拮抗剂。2.根据权利要求1所述的方法，其中施用一定量的Cx43半通道蛋白拮抗剂。3.根据权利要求1所述的方法，其中施用一定量的Panx1半通道蛋白拮抗剂。4.一种治疗受试者中脓毒症或内毒素血症、或减少或抑制受试者中脓毒症发展的方法，所述方法包括向受试者施用足以治疗脓毒症或内毒素血症、或足以减少或抑制脓毒症的发展的一定量的Cx43半通道蛋白表达抑制剂或一定量的Panx1半通道蛋白表达抑制剂。5.根据权利要求4所述的方法，其中施用一定量的Cx43半通道蛋白表达抑制剂。6.根据权利要求4所述的方法，其中施用一定量的Panx1半通道蛋白表达抑制剂。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述受试者已经患有脓毒症，并且所述方法用于治疗所述受试者中的脓毒症。8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述方法用于减少或抑制所述受试者中脓毒症的发展。9.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述受试者已经患有内毒素血症，并且所述方法用于治疗所述受试者中的内毒素血症。10.根据权利要求1-2或7-9中任一项所述的方法，其中所述Cx43半通道蛋白拮抗剂是肽拮抗剂。11.根据权利要求1、3或7-9中任一项所述的方法，其中所述Panx1半通道蛋白拮抗剂是肽拮抗剂。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述肽拮抗剂是具有Cx43半通道的胞外域的序列的肽。13.根据权利要求1-2或7-9中任一项所述的方法，其中所述Cx43半通道蛋白的拮抗剂包含具有序列ENVCYD(SEQIDNO：1)或N...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海潮，李威，凯文·J·翠西，王平，
申请(专利权)人：范斯坦医药研究院，
类型：发明
国别省市：美国,US