鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记、鉴定方法及应用技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，公开了一种鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记、鉴定方法及应用，所述分子标记为Pib‑TPAP，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Pib‑TPAP‑O‑F、SEQ ID NO.2所示的Pib‑TPAP‑O‑R、SEQ ID NO.3所示的Pib‑TPAP‑I‑F和SEQ ID NO.4所示的Pib‑TPAP‑I‑R。该分子标记可以对Pib基因的水稻稻瘟病菌抗性的两种等位基因型进行直接鉴定，该分子标记基于PCR技术，无需测序或酶切，仅一次PCR即可准确鉴定抗感两种等位基因型，大大提高了该基因位点的检测效率，且准确率达100％。

Identification, identification and application of rice blast resistance traits

The invention belongs to the field of molecular biology technology, and discloses a molecular marker, identification method and application for identification of rice blast resistance traits. The molecule is labeled as Pib TPAP, including the nucleotide sequence, such as the Pib TPAP O, as shown in the Pib TPAP O, F and SEQ ID NO.2. The Pib Pib TPAP TPAP I I F TPAP and Pib ID TPAP NO.4 I. The molecular markers can be used to directly identify two alleles resistant to rice blast resistance of Pib gene. The molecular marker is based on PCR technology without sequencing or enzyme cutting. Only one time PCR can accurately identify the two alleles of anti allelic, which greatly improves the detection efficiency of the gene site and the accuracy rate is 100%.

【技术实现步骤摘要】
鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记、鉴定方法及应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记、鉴定方法及应用。
技术介绍
由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起水稻大幅度减产，严重时造成颗粒无收，严重影响着我国的粮食安全生产。历史实践证明，选育抗稻瘟病水稻品种是减轻稻瘟病危害的最有效解决方案。而由于稻瘟病的抗性鉴定较为繁琐，受年纪间影响较大，通过分子标记辅助进行抗稻瘟病品种的选择可以大大提高选择效率，不受外部自然环境的影响，是改良水稻稻瘟病抗性的最佳手段。目前，已有24个抗稻瘟病基因被成功克隆，分布于水稻除第3号染色体的所有染色体上。Pib基因于1996年被成功克隆，属于"NBS-LRR"类抗病基因，包含有4个内含子(164bp,810bp,1340bp,308bp)，全长cDNA由306bp的5'非翻译区(UTR,untranslatedregions)、3753bp的ORF和229bp的3'非翻译区等组成。Pib基因为水稻主效抗稻瘟病基因，被定为位于水稻第12染色体长臂近末端区域，存在抗感两种等位基因型，其功能性由单碱基核苷酸多态性决定。Pib编码一个由1251个氨基酸组成的蛋白产物，该产物包含一个核苷酸结合位点(nucleotidebindingsite,NBS)和17个富亮氨酸重复序列(leucine-richrepeats,LRRs)，其中，氨基端的NBS区存在激酶1a,2和3a结构域单位，LRRs中部有8个成簇的半胱氨酸残基。由于Pib基因的抗感等位基因型由单碱基核苷酸多态性决定，检测依赖于测序或多次PCR进行检测。目前，应用较广检测Pib基因的抗感等位基因型的标记为刘洋等开发的2对检测标记Pibdom和Lys145,该检测体系需要两对引物共同检测确认Pib基因的抗感等位基因型。目前，稻瘟病的抗性鉴定可以通过表型和基因型两种形式进行鉴定，表型鉴定受年纪间影响较大，操作繁琐。基因型虽然鉴定准确、效率较高，但是目前Pib基因的抗感等位基因型检测依赖于测序或多次PCR检测。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供的一种鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记、鉴定方法及应用，克服了表型鉴定受年纪间影响较大，操作繁琐的缺陷，也克服了目前Pib基因的抗感等位基因型检测依赖于测序或多次PCR检测的缺陷。本专利技术提供了一种鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记，所述分子标记为Pib-TPAP，包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的Pib-TPAP-O-F、SEQIDNO.2所示的Pib-TPAP-O-R、SEQIDNO.3所示的Pib-TPAP-I-F和SEQIDNO.4所示的Pib-TPAP-I-R。本专利技术还提供了一种利用上述分子标记鉴定水稻稻瘟病抗性性状的方法，包括以下步骤：S1，提取待测水稻材料的基因组DNA；S2，以S1获得的基因组DNA为模板，以Pib-TPAP-O-F、Pib-TPAP-O-R、Pib-TPAP-I-F和Pib-TPAP-I-R为引物进行PCR扩增；S3，结果判定以Pib-TPAP-O-F与Pib-TPAP-O-R结合扩增出362bp片段作为阳性对照；当Pib-TPAP-I-F与Pib-TPAP-O-R结合扩增出194bp片段时，检测材料携带感病等位基因型C；当Pib-TPAP-O-F与Pib-TPAP-I-R结合扩增出227bp片段时，检测材料携带抗病等位基因型A。优选的，上述鉴定水稻稻瘟病抗性性状的方法中，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s-50s、35次循环；72℃延伸10min；4℃冷却10min。本专利技术还提供了一种上述的分子标记在水稻稻瘟病抗性性状分子标记辅助选育中的应用。本专利技术还提供了一种上述的鉴定水稻稻瘟病抗性性状的方法在水稻稻瘟病抗性性状分子标记辅助选育中的应用。与现有技术相比，本专利技术提供一种鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记、鉴定方法及应用，具有以下有益效果：本专利技术针对Pib基因的功能性单碱基核苷酸A-C的多态性，基于四引物扩增受阻突变原理，开发了检测Pib基因抗感等位基因型的功能性检测标记Pib-TPAP。分子标记Pib-TPAP是从DNA碱基的功能性多态性进行鉴定，专利技术人经过大量试验材料证实该分子标记可以对Pib基因的水稻稻瘟病菌抗性的两种等位基因型进行直接鉴定，该分子标记基于PCR技术，无需测序或酶切，仅一次PCR即可准确鉴定抗感两种等位基因型，大大提高了该基因位点的检测效率，且准确率达100％，能够较好区分两种等位基因型，不受环境条件的影响，鉴定操作方法简单，耗费较低，而其他现有文献公开的引物分子标记只能达到50-70％的鉴定准确率；本专利技术的分子标记Pib-TPAP为Pib基因等位基因型的鉴定及相应的分子标记辅助选择工作打下了坚实的基础，适合于大范围推广使用。附图说明图1为日本晴材料的Pib基因；图2为武运粳27号的Pib基因；图3为不同退火温度组进行PCR扩增结果；其中，M泳道为DNA标准分子量；1、3、5、7、9、11、13、15、17泳道分别为武运粳27号材料在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃退火温度下的扩增结果；2、3、4、5、10、12、14、16、18泳道分别为日本晴材料在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃退火温度下的扩增结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明，但不应理解为本专利技术的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本专利技术提供的一种鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记，所述分子标记为Pib-TPAP，包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的Pib-TPAP-O-F、SEQIDNO.2所示的Pib-TPAP-O-R、SEQIDNO.3所示的Pib-TPAP-I-F和SEQIDNO.4所示的Pib-TPAP-I-R。具体按照以下方法获得：参照MasaruMiyamoto等研究(MasaruMiyamoto；IkuoAndo；KrystynaRybka；OsamuKodama；ShinjiKawasakiHighResolutionMappingoftheIndica-DerivedRiceBlastResistanceGenes.I.Pi-bMolecularPlant-MicrobeInteractions,1996,9(1):6-13)，NCBI查找克隆序列[AB013448]，选用NCBI提供序列的8719处A-C的SNP进行设计。对照品种为抗病品种“武运粳27号”，感病品种“日本晴”。利用在线引物设计软件Primer1进行标记设计，命名为Pib-TPAP，Pib-TPAP包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的Pib-TPAP-O-F、SEQIDNO.2所示的Pib-TPAP-O-R、SEQIDNO.3所示的Pib-TPAP-I-F和SEQIDNO.4所示的Pib-TPAP-I-R，其序列信息详见表1。SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记，其特征在于，所述分子标记为Pib‑TPAP，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Pib‑TPAP‑O‑F、SEQ ID NO.2所示的Pib‑TPAP‑O‑R、SEQ ID NO.3所示的Pib‑TPAP‑I‑F和SEQ ID NO.4所示的Pib‑TPAP‑I‑R。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定水稻稻瘟病抗性性状的分子标记，其特征在于，所述分子标记为Pib-TPAP，包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的Pib-TPAP-O-F、SEQIDNO.2所示的Pib-TPAP-O-R、SEQIDNO.3所示的Pib-TPAP-I-F和SEQIDNO.4所示的Pib-TPAP-I-R。2.一种利用权利要求1所述的分子标记鉴定水稻稻瘟病抗性性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，提取待测水稻材料的基因组DNA；S2，以S1获得的基因组DNA为模板，以Pib-TPAP-O-F、Pib-TPAP-O-R、Pib-TPAP-I-F和Pib-TPAP-I-R为引物进行PCR扩增；S3，结果判定以Pib-TPAP-O-F与Pib-TPAP-O-R结...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛艇，张丽丽，刘妍，赵一洲，李鑫，张战，李旭，倪善军，付雪娇，黄河，于小彭，荆华，宋双，李振宇，刘福才，
申请(专利权)人：辽宁省盐碱地利用研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21