冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。本发明专利技术以冬虫夏草菌培养液的基因组DNA为模板，采用本发明专利技术设计的检测引物组，进行2次单管特异PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的存在情况。本发明专利技术建立了一种通过常规PCR反应检测冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的携带情况，只需DNA提取、PCR扩增和电泳检测三步即可完成对样品的检测，操作简单、易于掌握、准确性高，通过本发明专利技术的方法可以进一步开发检测试剂盒。本发明专利技术为排除携带蝙蝠蛾拟青霉的冬虫夏草菌培养液提供了新的方法，为提高冬虫夏草菌对蝠蛾幼虫的侵染率及其子座形成提供技术支撑。

Detection primers, detection kits and detection methods for Paecilomyces Paecilomyces in Cordyceps sinensis culture medium

The invention discloses a detection primer group, a detection kit and a detection method for a Paecilomyces moth in the culture medium of Cordyceps sinensis. The present invention takes the genomic DNA of the culture medium of Cordyceps sinensis as a template, and uses the detection primer group designed by the invention to carry out 2 single tube specific PCR reactions and detect the amplified products by agarose gel electrophoresis to determine the existence of Paecilomyces bats in the culture fluid of Cordyceps sinensis. The present invention has established a normal PCR reaction to detect the carrying situation of Paecilomyces bats in the culture medium of Cordyceps sinensis bacteria. Only DNA extraction, PCR amplification and electrophoresis detection can be used to detect the samples. The operation is simple, easy to master and high accuracy. The detection reagents can be further developed through the method of the invention. Box. The present invention provides a new method for eliminating the culture medium of Cordyceps sinensis with Paecilomyces moth. It provides technical support for improving the infection rate of the larvae of the bat moth and the formation of its ovary.

【技术实现步骤摘要】
冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测方法
：本专利技术属于生物工程
，具体涉及冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。
技术介绍
：冬虫夏草是冬虫夏草菌Ophiocordycepssinensis(Berk)侵染蝙蝠蛾科Hepialidae幼虫形成的僵虫与真菌子座复合体，与人参、鹿茸被誉为中华医学三大宝。由于其生境特殊(仅在高寒地区自然繁衍)，生长速度缓慢，周期较长，自然资源极为有限，有关部门已将冬虫夏草列为国家二级保护物种。人工培育冬虫夏草是保护生物资源和生态环境的需要，也是国民需求和市场的需要。经过30多年的研究，虽然一些研究团队已经掌握冬虫夏草菌的人工培养技术和寄主蝠蛾幼虫的规模化饲养技术，但用冬虫夏草菌侵染幼虫形成僵虫的成功率以及僵虫生长出子座的成功率都非常低。蝙蝠蛾拟青霉PaecilomyceshepialiChenetDai是天然冬虫夏草的一种寄生菌，生长发育速度较冬虫夏草菌快，对蝠蛾幼虫的侵染力更强，即使用于侵染蝠蛾幼虫的冬虫夏草菌培养液中存在少量的蝙蝠蛾拟青霉，都会造成蝠蛾幼虫因感染蝙蝠蛾拟青霉而大量死亡，严重影响中华被毛孢成功侵染蝠蛾幼虫及其子座的形成，是目前制约冬虫夏草人工培育的瓶颈因素。因此，建立一种准确、灵敏、快速、经济的冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉鉴定方法，排除携带蝙蝠蛾拟青霉的冬虫夏草菌培养液，是提高冬虫夏草人工培育成功率的一个关键因素。关于冬虫夏草菌和蝙蝠蛾拟青霉的区分鉴定，目前可以通过常规培养后镜检的菌丝和孢子形态差异来鉴定，但由于蝙蝠蛾拟青霉在纯化培养的冬虫夏草菌液中含量少或无，取样镜检不仅容易造成漏检，准确度不高，且操作费时，需要操作人员具备专业的理论和实践知识。目前尚没有专门用于检测冬虫夏草菌培养液质量的标准方法，菌液质量难以保证，极大限制了冬虫夏草人工培育产业的发展。因此，在冬虫夏草人工培育过程中，亟需一种灵敏、快速、准确的冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉检测方法，以实现对冬虫夏草菌液品质的控制和管理。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。利用本专利技术的检测引物组和检测试剂盒，按照本专利技术的检测方法能够准确、快速、经济的检测出冬虫夏草菌培养液中的蝙蝠蛾拟青霉，从而判定用于侵染蝠蛾幼虫的冬虫夏草菌培养液的质量，本专利技术具有准确、快速、经济、准确性高的优点。本专利技术第一个目的是提供冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组，包括2对特异引物：第一对特异引物：Ph816F：5’-CCTTTTGTGAACATACCTATC-3’(如SEQIDNO.1所示)；Ph1302R：5’-GAGGTCAACGTTCAGAAGTC-3’(如SEQIDNO.2所示)；第二对特异引物：Ph935F：5’-GTATCTTCTGAATCCGCCGCA-3’(如SEQIDNO.3所示)；Ph1162R：5’-CCGATTTCCCCAAAGGGAAG-3’(如SEQIDNO.4所示)。本专利技术的第二个目的是提供一种冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测试剂盒，包括PCR反应试剂和检测引物组，所述的检测引物组包括2对特异引物：第一对特异引物：Ph816F：5’-CCTTTTGTGAACATACCTATC-3’(如SEQIDNO.1所示)；Ph1302R：5’-GAGGTCAACGTTCAGAAGTC-3’(如SEQIDNO.2所示)；第二对特异引物：Ph935F：5’-GTATCTTCTGAATCCGCCGCA-3’(如SEQIDNO.3所示)；Ph1162R：5’-CCGATTTCCCCAAAGGGAAG-3’(如SEQIDNO.4所示)。本专利技术的第三个目的是提供基于降低冬虫夏草菌侵染蝠蛾幼虫过程中幼虫感染蝙蝠蛾拟青霉死亡率目的的冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测方法，包括以下步骤：提取待测冬虫夏草菌培养液的基因组DNA作为模板，使用上述的第一对特异引物Ph816F和Ph1302R进行第一轮PCR扩增，以稀释后的第一轮PCR扩增的PCR反应产物为模板，使用上述的第二对特异引物Ph935F和Ph1162R进行第二轮PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测第一轮和第二轮PCR扩增的PCR反应产物，若第一轮PCR产物在487bp处有电泳条带和第二轮PCR产物在228bp处有电泳条带，均说明冬虫夏草菌培养液中有蝙蝠蛾拟青霉，若无电泳条带，则说明冬虫夏草菌培养液中没有蝙蝠蛾拟青霉。所述的第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增，其反应体系均优选为25μL：包括10×TaqBuffer2.5μL、2.5mMdNTPs2μL、10μM正向引物0.5μL、10μM反向引物0.5μL、5U/μL高保真TaqDNA聚合酶0.5μL和模板DNA2μL，余量用ddH2O补足至总体积25μL。所述的第一轮PCR扩增，其反应条件优选为：94℃3～5min；94℃30sec，48℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃5～10min。所述的第二轮PCR扩增，其反应条件优选为：94℃3～5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，35个循环；72℃5～10min。需要说明的是，冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测方法。本专利技术的对象是检测纯化培养的冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的存在情况，因为侵染蝠蛾幼虫的冬虫夏草菌培养液中即使存在少量的蝙蝠蛾拟青霉都会快速致死幼虫，降低冬虫夏草菌的侵染成功率和子座形成。因此，本专利技术通过抽取用于侵染的冬虫夏草菌培养液，提取其基因组DNA，利用蝙蝠蛾拟青霉特异引物，对蝙蝠蛾拟青霉进行检测，从而排除携带蝙蝠蛾拟青霉的冬虫夏草菌培养液，不将其作为侵染蝠蛾幼虫的母种，即节省了携带蝙蝠蛾拟青霉的冬虫夏草菌培养成本和时间，也有利于提高冬虫夏草菌的成功侵染率。本专利技术建立了一种简单的单管PCR反应检测冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的方法，本专利技术的引物特异性强，PCR扩增条件简单，采用单管特异PCR反应后，通过电泳检测便可排除携带蝙蝠蛾拟青霉的冬虫夏草菌培养液，方法简单、快速、准确、成本低，并且通过本专利技术的方法可以进一步开发检测试剂盒，为提高人工培育冬虫夏草菌的侵染率，发展冬虫夏草人工培育产业提供了坚实的技术支撑。附图说明：图1是蝙蝠蛾拟青霉特异引物设计示意图(GenBank:EF555097.3)，其中黑色箭头指明的是第一对特异引物的位置和对应的核苷酸序列，灰色箭头指明的是第二对特异引物的位置和对应的核苷酸序列。图2是利用本专利技术的检测引物组和检测方法对纯化的冬虫夏草菌、蝙蝠蛾拟青霉及两者等量杂合模板DNA的扩增结果，泳道1-3为第一对特异引物的PCR扩增电泳图(目的条带487bp)，泳道4-6为第二对特异引物的PCR扩增电泳图(目的条带228bp)；泳道1和4为冬虫夏草菌基因组DNA，泳道2和5为蝙蝠蛾拟青霉基因组DNA，泳道3和6为冬虫夏草菌和蝙蝠蛾拟青霉等量杂合模板DNA；M：DL2000Marker。图3是PCR扩增不同占比的冬虫夏草菌和蝙蝠蛾拟青霉杂合模板DNA的电泳图谱验证特异引物组和检测方法的灵敏度；A为第一对特异引物的PCR扩增电泳图(目的条带487bp)，M：D本文档来自技高网...

【技术保护点】
冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组，其特征在于，包括2对特异引物：第一对特异引物：Ph816F：5’‑CCTTTTGTGAACATACCTATC‑3’；Ph1302R：5’‑GAGGTCAACGTTCAGAAGTC‑3’；第二对特异引物：Ph935F：5’‑GTATCTTCTGAATCCGCCGCA‑3’；Ph1162R：5’‑CCGATTTCCCCAAAGGGAAG‑3’。

【技术特征摘要】
1.冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组，其特征在于，包括2对特异引物：第一对特异引物：Ph816F：5’-CCTTTTGTGAACATACCTATC-3’；Ph1302R：5’-GAGGTCAACGTTCAGAAGTC-3’；第二对特异引物：Ph935F：5’-GTATCTTCTGAATCCGCCGCA-3’；Ph1162R：5’-CCGATTTCCCCAAAGGGAAG-3’。2.一种冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测试剂盒，包括PCR反应试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组包括2对特异引物：第一对特异引物：Ph816F：5’-CCTTTTGTGAACATACCTATC-3’；Ph1302R：5’-GAGGTCAACGTTCAGAAGTC-3’；第二对特异引物：Ph935F：5’-GTATCTTCTGAATCCGCCGCA-3’；Ph1162R：5’-CCGATTTCCCCAAAGGGAAG-3’。3.基于降低冬虫夏草菌侵染蝠蛾幼虫过程中幼虫感染蝙蝠蛾拟青霉死亡率目的的冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测冬虫夏草菌培养液的基因组DNA作为模板，使用权利要求1所述的第一对特异引物Ph816F和Ph1302R进行第一轮PCR扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘桂清，韩日畴，
申请(专利权)人：广东省生物资源应用研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44