一种绝对定量检测副溶血性弧菌的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开一种绝对定量检测副溶血弧菌的试剂盒及检测方法，属于分子生物学领域。本发明专利技术提供了一组绝对定量检测副溶血性弧菌的引物和探针，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。本发明专利技术还提供了一种利用微滴式数字聚合酶链式反应绝对定量检测副溶血性弧菌的方法，该方法特异性强、灵敏度高、重复性好，可操作性强，易于标准化。

An absolute quantitative detection kit for Vibrio parahaemolyticus and its detection method

The invention discloses a reagent kit and a detection method for absolute quantitative detection of Vibrio parahaemolyticus, and belongs to the field of molecular biology. The present invention provides a set of primers and probes for the absolute quantitative detection of Vibrio parahaemolyticus. The nucleotide sequence of the primers is shown by SEQ ID No.1 and SEQ ID No.2, and the nucleotide sequence of the probe is shown by SEQ ID ID No.3. The invention also provides a method for the absolute detection of Vibrio parahaemolyticus by using the micro drop digital polymerase chain reaction. This method has strong specificity, high sensitivity, good repeatability, strong operability and easy standardization.

【技术实现步骤摘要】
一种绝对定量检测副溶血性弧菌的试剂盒及检测方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种绝对定量检测副溶血性弧菌的引物/探针和试剂盒，更具体地，涉及一种绝对定量检测副溶血性弧菌的微滴式数字聚合酶链式反应(dropletdigitalpolymerasechainreaction,ddPCR)试剂盒和检测方法。
技术介绍
副溶血性弧菌是一种嗜盐性的革兰氏阴性菌，广泛存在于海水和海产品中，是中国沿海地区最常见的食物中毒病原菌。其致病性跟食物中的带菌量密切相关，总副溶血性弧菌的数量是经常被用来评价食物污染程度的一个重要指标。如中国“食品安全国家标准食品中致病菌限量(GB29921-2013)”中明确提出水产制品及水产调味品中副溶血性弧菌的最低限量为100MPN/g；日本也要求生食的鱼片和贝类中副溶血性弧菌的总数不得超过100CFU/g。因此，为保障食品卫生质量和食用安全，有必要对食品中副溶血性弧菌进行定量检测。当前副溶血性弧菌定量检测的主要手段仍是以传统的MPN法为主，如中国食品安全国家标准“食品微生物学检验副溶血性弧菌检验(GB4789.7-2013)”即采用该方法。然而MNP法是一种概率估算细菌浓度的方法，在实际应用中存在着诸多缺点：1)需要对样品进行复杂的梯度稀释和检测重复，稀释的精确性会直接影响定量结果；2)需要进行增菌培养，不仅费时，而且样品中潜在的其他杂菌有可能会因过度增殖而给目标菌鉴定造成干扰；3)仍需要经过选择性平板分离、生化鉴定等复杂的过程，检测时间一般需要3～5天；4)食品中的副溶血性弧菌经常以“活的不可培养状态(VBNC)”存在，MPN法无法有效检测到这部分细菌，从而影响检测结果的准确性。近年来，以实时荧光PCR(qPCR)为代表的分子生物学技术也逐渐被广泛应用到副溶血性弧菌的定量检测中去。相比较于传统培养法，qPCR快速，简便，灵敏、特异，但该方法属于相对定量，结果的准确性和重复性在很大程度上依赖于所绘制的标准曲线质量及扩增效率，并且需要具备已知浓度的核酸标准品。目前尚没有一个官方权威机构可以提供这种具有明确量值(即核酸拷贝数或质量浓度)的副溶血性弧菌核酸标准品。在实际检测中对自行构建的核酸标准分子的定量分析多采用紫外分光光度法，得到的是260nm处所有核酸分子的吸光度值，标准品中其他DNA或RNA分子以及蛋白等杂质成分均会影响测定结果的准确性。正是由于qPCR定量检测中缺乏统一的核酸标准品，加上样品中存在不同程度的核酸扩增抑制成分干扰导致扩增效率的差异，因此，不同实验室间qPCR的定量检测结果往往缺少可比性。新兴的微滴式数字PCR(ddPCR)被认为是第三代核酸扩增技术，通过把稀释到一定浓度的DNA分子分布到10000～20000个微滴中，使大部分微滴中DNA分子的数量为1或0，然后通过PCR扩增和阳性信号的累积来读取阳性反应单元数，再根据泊松分布计算出样本中的DNA分子数，从而实现对DNA分子的绝对定量。目前该技术用于微生物的定量分析尚处于起步阶段，相关的研究如临床样本中人疱疹病毒、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、沙眼衣原体、寄生虫隐孢子虫，牛粪便样本中产志贺毒素的大肠埃希氏菌，以及导致梨火疫病和马铃薯褐腐菌病的植物病原菌等，尚未见到可用于食品中副溶血性弧菌定量检测的相关报道。由于食品基质多富含蛋白、脂肪、果胶等核酸扩增抑制成分，背景菌构成复杂且浓度较高，因此，ddPCR对食品中副溶血性弧菌定量分析的有效性和实用性尚未可知，开发空间和应用前景广阔。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一组特异性强、灵敏度高、重复性好的用于检测副溶血性弧菌的ddPCR引物和探针；本专利技术的第二个目的在于提供一种操作简单、精确度高的绝对定量检测副溶血性弧菌的ddPCR试剂盒；本专利技术的第三个目的在于提供一种绝对定量检测副溶血性弧菌的ddPCR方法。为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：本专利技术通过选取副溶血性弧菌具有种属特异性且高度保守的单拷贝β-内酰胺酶编码基因blaCARB作为靶序列，设计出4对引物和探针组合，具体序列见表1，经过筛选最终获得特异性强、适用于ddPCR扩增条件的引物/探针1套(blaCARB-F3/R3/P3)，其中，探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ。表1ddPCR引物和探针序列a)引物/探针位置参考GenBankno.NG_048735.1序列信息。本专利技术绝对定量检测副溶血性弧菌的ddPCR试剂盒，该试剂盒包含上述ddPCR引物和探针序列。进一步，试剂盒还包括完成ddPCR反应所需材料和试剂，如副溶血性弧菌阳性对照DNA、ddPCRmastermix、微滴生成油、微滴生成卡、TwinTecSemi-Skirted96孔板、铝箔热封膜。本专利技术还提供了绝对定量检测副溶血性弧菌的ddPCR检测方法，包括：(1)提取待测样品基因组的DNA；(2)配置ddPCR反应体系：具体见表2，包括序列表中SEQIDNO.1至SEQIDNO.3所示的引物和探针；表2ddPCR反应体系(3)微滴生成：将ddPCR反应体系和微滴生成油加入到微滴生成卡中，置于微滴生成仪中生成微滴。(4)扩增反应：将生成的微滴转移到96孔板中，封膜后置于PCR仪(GeneAmp9700,AppliedBioSystems,FosterCity,CA)上进行扩增反应，具体条件见表3；表3ddPCR反应条件注：升降温速度应≤2.5℃/s(5)结果判定将扩增后的96孔板置于微滴读取仪(QX100,Bio-Rad,Pleasanton,CA)中，利用QuantaSoft软件进行结果读取和分析。含有扩增产物的阳性微滴与不含扩增产物的阴性微滴会呈现出荧光信号强度的差异，以阴性微滴簇荧光幅度的最高点为界来设定阈值线。按照泊松分布原理计算获得副溶血性弧菌blaCARB基因的拷贝数。本专利技术的有益效果如下：本专利技术针对副溶血性弧菌的ddPCR定量检测方法和试剂盒不仅适用于粪便等临床样本，更适于对水产等食品样品的检测，为水产等高风险食品提供了一种新的副溶血性弧菌定量检测方法，为保障食品安全、开展风险评估等工作提供了有力的武器。具体而言，该ddPCR定量检测技术较传统MPN法和qPCR法具有以下优势：1)ddPCR针对副溶血性弧菌单拷贝基因blaACARB-17进行直接绝对定量，检测灵敏度可以达到40拷贝(CFU)/g，满足国内外对食品中副溶血性弧菌污染最低控制水平的要求；2)无需进行增菌培养及后续的特征性菌落鉴定、生化分析等步骤，大幅缩短检测时间，简化操作流程；3)直接提取水产等样品匀浆DNA，无需对样品进行复杂的稀释和检测重复，减少了稀释偏差对定值结果的影响；4)ddPCR针对细菌基因组的检测，能有效检测到活的不可培养状态(VBNC)的细菌，从而弥补MPN和平板计数等培养法在VBNC细菌检测中的欠缺；5)无需依赖任何核酸标准品，不需要绘制标准曲线，避免了由PCR扩增效率差异所导致的偏差；6)由于ddPCR是终点检测，对样品中抑制剂的耐受度更高；7)特别适于低污染水平样品的定量分析，具有更高的精确度和重复性，易于标准化。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。图1示qPCR对引物探针的筛选(A)与特异性验证(B)；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组绝对定量检测副溶血性弧菌的引物和探针，其特征在于：所述引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

【技术特征摘要】
1.一组绝对定量检测副溶血性弧菌的引物和探针，其特征在于：所述引物的核苷酸序列为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，所述探针的核苷酸序列为SEQIDNo.3所示。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ。3.权利要求1或2所述引物和探针在制备绝对定量检测副溶血性弧菌试剂盒中的应用。4.一种绝对定量检测副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1或2所述的引物和探针。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：副溶血性弧菌阳性对照DNA、ddPCRmastermix、微滴生成油、微滴生成卡、TwinTecSemi-Skirted96孔板、铝箔...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏海燕，马丹，魏咏新，曾静，周熙成，张西萌，付溥博，汪琦，徐蕾蕊，李丹，刘莉，赵晓娟，
申请(专利权)人：北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：北京,11