体外检测上皮肿瘤细胞培养物对治疗剂反应性的方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及体外检测上皮肿瘤细胞培养物对治疗剂反应性的方法和试剂盒。本发明专利技术的方法和试剂盒可特别用于进行抗肿瘤治疗剂的体外筛选或药物研发。

Method and kit for in vitro detection of reactivity of epithelial tumor cell cultures to therapeutic agents

The invention relates to a method and kit for in vitro detection of reactivity of epithelial tumor cell cultures to therapeutic agents. The method and kit of the invention can be used for screening or drug development of anticancer agents in particular.

【技术实现步骤摘要】
体外检测上皮肿瘤细胞培养物对治疗剂反应性的方法和试剂盒
本专利技术涉及体外检测上皮肿瘤细胞培养物对治疗剂反应性的方法和试剂盒。本专利技术的方法和试剂盒可特别用于进行抗肿瘤治疗剂的体外筛选。
技术介绍
尽管不断努力改进诊断和治疗，但癌症仍然是全球死亡的主要原因。癌症的多样性或异质性对新疗法的发展构成障碍，也难以识别可能的应答者。此外，许多癌症治疗受到原发耐性(primaryresistance)和获得性耐性(acquiredresistance)的挑战，包括绕开治疗试剂靶点的替代途径和额外的点突变。未来成功的治疗方法可能依赖于对肿瘤进展和转移过程所依据的事件的综合分析，以及快速和非选择性生成患者来源的原代肿瘤细胞的发展，所述细胞可以容易地操作以准确评估化学治疗剂和靶向治疗剂的功效。作为一个例子，已经描述了使用经辐射的饲养细胞和Rho激酶抑制剂Y27632的癌细胞的原代培养物来促进异源肿瘤上皮细胞的生长并调查个体患者的药物敏感性(参见例如Liu等人，AmJPathol，180：599-607，2012)。然而，当仅仅接种来自患者肿瘤的分离的单个细胞时，这些共培养条件受到基质细胞及正常上皮细胞过度生长的困扰。解决这种基质细胞污染的一种方法是使用FACS来净化上皮细胞粘附分子(EpCAM)阳性细胞亚群。但是基于细胞表面标志物表达的纯化增加了来源于原始患者肿瘤的肿瘤细胞的克隆选择的风险，因此通常不能公平地代表原始患者肿瘤的克隆多样性。因此，需要开发用于在饲养细胞和Rock抑制剂系统中富集原代上皮肿瘤细胞的改善的培养条件，其不仅降低基质细胞和/或正常上皮细胞生长，而且还维持原始肿瘤样品的克隆多样性。另外，目前所用的体外药筛方法由于体外重编程培养过程中出现正常细胞的干扰以及使用的筛选手段的限制，最终往往无法快速有效地获得体外药筛的准确结果。因此，也需要一种能够防止正常细胞的干扰、准确性提高的体外药物筛选方法。
技术实现思路
本专利技术涉及用于体外检测人上皮肿瘤细胞培养物对治疗剂的反应性的方法，包括：(a)将包含人上皮肿瘤细胞的人离体来源的癌组织起源球状体(CTOS)解离成基本上单细胞的悬浮液，(b)在确定成分的细胞培养基中与饲养细胞共培养由步骤(a)解离的CTOS，所述确定成分的细胞培养基包含至少一种Rho相关的含盘绕圈的蛋白激酶(ROCK)抑制剂，并且不含或基本不含骨形态生成蛋白(BMP)抑制剂和Wnt/β-连环蛋白信号通路激动剂，(c)将治疗剂施用到步骤(b)得到的培养物中，和(d)测量上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡，其中上皮肿瘤细胞增殖的减少和/或上皮肿瘤细胞凋亡的诱导指示了培养物对治疗剂的反应性，其中缺乏上皮肿瘤细胞增殖的减少和/或上皮细胞凋亡的诱导指示了培养物对治疗剂的抗性。在文本中，癌组织起源球状体(cancer-tissueoriginatedspheroid)亦简称为CTOS。CTOS是现有技术公知的，关于CTOS的相关讨论、获取和处理方法，可参见：例如，Kondoetal.,PNASUSA.108:6235-6240,2011；Endoetal.,JThoracOncol.8:131-9,2013；WO2012065067；和Liuetal.,AmJPathol.180:599-607,2012等文献。在一些实施方案中，人离体来源的CTOS(humanexvivo-derivedCTOS)是从患癌症的人患者移除的肿瘤样品培养获得的，所述肿瘤样品例如选自手术样品、活检样品、胸腔积液样品和腹水样品。在一些实施方案中，人患者具有选自结肠癌、结直肠癌、肺癌、胃癌和乳腺癌的癌症。在一些实施方案中，人上皮肿瘤细胞选自结肠癌细胞、结直肠癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞和乳腺癌细胞。在本申请中，“确定成分的细胞培养基”，亦称“确定成分的培养基”(“definedmedium”)，是指适用于人或动物细胞的体外或离体培养的生长培养基，其化学组成是已知的。在一些实施方案中，确定成分的培养基包含血清，例如胎牛血清(FBS)或小牛血清(fetalcalfserum，FCS)。在一些实施方案中，血清的浓度为约1-5％，或约1％、2％、3％、4％或5％。在一些实施方案中，确定成分的培养基不含血清或基本上不含血清，即培养基缺乏或基本上缺乏加入的血清，例如FBS或FCS。在一些实施方案中，确定成分的培养基包括基础培养基，例如DMEM、F12、RPMI1640、hESCSFM或其组合，例如DMEM/F12，其可以补充有另外的组分，例如生长因子、抗氧化剂和/或能量来源。因此，在特定实施方案中，确定成分的培养基包括Dulbecco'sModifiedEaglesMedium(DMEM)、Ham'sNutrientMixture(F12)、RPMI1640、DMEM/F12或hESCSFM。在一些实施方案中，培养基包括例如比值为约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10的DMEM/F12。在某些实施方案中，所述培养或扩增上皮肿瘤细胞的方法不使用细胞外基质(ECM)组分。ECM的具体实例包括胶原、基质胶、层粘连蛋白和纤连蛋白。“Rho相关的含螺旋线圈的蛋白激酶抑制剂”，在本领域是公知的，亦称为“Rho激酶抑制剂”或“ROCK抑制剂”(Rho激酶简称为ROCK)。作为ROCK抑制剂，可以使用例如ROCK-1和/或ROCK-2抑制剂。在本专利技术的一些实施方式中，所述ROCK抑制剂选自Y27632、HA1100盐酸盐、HA1077和GSK429286中的一种或多种。ROCK抑制剂例如Y27632的浓度范围是约0.1-1000、0.5-1000、1-1000、5-1000、10-1000、50-1000、100-1000、500-1000μM，或约0.1-500、0.5-500、1-500、5-500、10-500、50-500、100-500μM，或约0.1-100、0.5-100、1-100、5-100、10-100、50-100μM，或约0.1-50、0.5-50、1-50、5-50、10-50μM，或约0.1-40、0.5-40、1-40、5-40、10-40μM，或约0.1-30、0.5-30、1-30、5-30、10-30μM，或约0.1-20、0.5-20、1-20、5-20、10-20μM，或约0.1-10、0.5-10、1-10、5-10μM，或约0.1-5、0.5-5、1-5μM，或约0.1-1或0.5-1μM。步骤(b)中的饲养细胞可以从任何哺乳动物获得，且饲养细胞的动物来源不需要与所培养的CTOS的动物来源相同。例如，饲养细胞的示例性来源包括但不限于小鼠、大鼠、犬科动物、猫科动物、牛、马、猪、非人灵长类动物和人饲养细胞。特定类型的饲养细胞包括脾细胞、巨噬细胞、胸腺细胞和成纤维细胞。在一些实施方案中，脾细胞、巨噬细胞、胸腺细胞和/或成纤维细胞是非增殖性的。一个特定的实例包括J2细胞，其是源自建立的Swiss3T3细胞系的小鼠成纤维细胞的亚克隆。在一些实施方案中，γ辐射J2细胞。在特定实施方案中，用丝裂霉素C处理J2细本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于体外检测人上皮肿瘤细胞培养物对治疗剂的反应性的方法，包括：(a)将包含人上皮肿瘤细胞的人离体来源的癌组织起源球状体(CTOS)解离成基本上单细胞的悬浮液，(b)在确定成分的细胞培养基中与饲养细胞共培养由步骤(a)解离的CTOS，所述确定成分的细胞培养基包含至少一种Rho相关的含盘绕圈的蛋白激酶(ROCK)抑制剂，并且不含或基本不含骨形态生成蛋白(BMP)抑制剂和Wnt/β‑连环蛋白信号通路激动剂，(c)将治疗剂施用到步骤(b)得到的培养物中，和(d)测量上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡，其中上皮肿瘤细胞增殖的减少和/或上皮肿瘤细胞凋亡的诱导指示了培养物对治疗剂的反应性，其中缺乏上皮肿瘤细胞增殖的减少和/或上皮细胞凋亡的诱导指示了培养物对治疗剂的抗性。

【技术特征摘要】
2016.11.21 CN PCT/CN2016/1066191.用于体外检测人上皮肿瘤细胞培养物对治疗剂的反应性的方法，包括：(a)将包含人上皮肿瘤细胞的人离体来源的癌组织起源球状体(CTOS)解离成基本上单细胞的悬浮液，(b)在确定成分的细胞培养基中与饲养细胞共培养由步骤(a)解离的CTOS，所述确定成分的细胞培养基包含至少一种Rho相关的含盘绕圈的蛋白激酶(ROCK)抑制剂，并且不含或基本不含骨形态生成蛋白(BMP)抑制剂和Wnt/β-连环蛋白信号通路激动剂，(c)将治疗剂施用到步骤(b)得到的培养物中，和(d)测量上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡，其中上皮肿瘤细胞增殖的减少和/或上皮肿瘤细胞凋亡的诱导指示了培养物对治疗剂的反应性，其中缺乏上皮肿瘤细胞增殖的减少和/或上皮细胞凋亡的诱导指示了培养物对治疗剂的抗性。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述BMP抑制剂是头蛋白。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述Wnt/β-连环蛋白信号通路激动剂是R-spondin-1。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法在步骤(a)和(b)之后约14天内在细胞培养基中提供至少约10％的肿瘤细胞增殖。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括在共培养解离的CTOS的同一天施用治疗剂。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括在共培养解离的CTOS后至少一天施用所述治疗剂。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括在共培养解离的CTOS后1、2、3、4、5、6或7天内施用所述治疗剂。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括在施用所述治疗剂的14天内测量上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括在施用所述治疗剂的14、13、12、11、10、9、8、7、6或5天内测量上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中测量上皮肿瘤细胞增殖的步骤包括测量细胞增殖标志物。11.根据权利要求11所述的方法，其中所述细胞增殖标志物选自3H-胸苷、溴脱氧尿苷(BrdU)、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(Edu)、Ki-67和增殖细胞核抗原(PCNA)中的一种或多种。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中测量上皮肿瘤细胞凋亡的步骤包括测量细胞凋亡标记。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞凋亡标志物选自荧光染料标记的半胱天冬酶抑制剂(FLICA)、半胱天冬酶激活、聚ADP核糖聚合酶(PARP)切割、DRAQ5、DRAQ7和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)dUTP切口标记(...

【专利技术属性】
技术研发人员：张一洪，杨振，陈一友，林艺海，曹志翔，
申请(专利权)人：北京智康博药肿瘤医学研究有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11