一种腺苷酸基琥珀酸或盐的制备方法技术

本发明专利技术属治疗糖脂代谢紊乱疾病候选药物的规模化生产技术领域，为解决现有S‑AMP难以生产，其价格昂贵，难以保证其成药性研究的原料来源问题，提供一种腺苷酸基琥珀酸或盐的制备方法，利用pET‑28‑a载体表达N末端带有His‑tag序列的PhAdSS，以此为催化剂催化肌苷酸IMP、L‑天冬氨酸和三磷酸鸟苷GTP，进行反应合成S‑AMP，反应结束后，用硅胶薄层层析分析产物中的成分，进行硅胶柱层析分离纯化S‑AMP。合成品内s‑AMP含量为61%，回收率约20%。制备流程简单，成本低廉，为建立工业化的S‑AMP合成工艺奠定基础。有望突破国外对S‑AMP的垄断性销售，可大幅度降低S‑AMP成药性研究成本。

A preparation method of adenosine acid succinic acid or salt

The invention is a large-scale production technology field for the treatment of glycolipid metabolic disorders candidate drugs. In order to solve the difficult production of existing S AMP, it is expensive and difficult to guarantee the source of raw material for the study of its drug resistance. A preparation method of adenosine acid succinic acid or salt is provided, and the N terminal with His is expressed with the pET a carrier to express the N terminal with His. PhAdSS of tag sequence was used as catalyst to catalyze the reaction of inosinic acid IMP, L aspartic acid and three guanosine phosphate GTP to synthesize S AMP. After the reaction, silica gel thin layer chromatography was used to analyze the components of the product, and the silica gel column chromatography was used to separate and purify AMP. The content of s AMP in the synthetic product is 61% and the recovery rate is about 20%. The preparation process is simple and the cost is low, which lays the foundation for the industrialization of S AMP synthesis process. It is expected to break through the monopolistic sales of S AMP, which can significantly reduce the cost of S AMP.

【技术实现步骤摘要】
一种腺苷酸基琥珀酸或盐的制备方法
本专利技术属于治疗糖脂代谢紊乱疾病候选药物的规模化生产的
，具体涉及一种腺苷酸基琥珀酸或盐的制备方法及其应用。利用深海古细菌来源的酶来催化合成一种天然腺苷类化合物：腺苷酸基琥珀酸(盐)，建立了实验室小试制备方法。这种化合物具有促进胰岛素分泌的功能，可作为改善糖脂代谢紊乱疾病的候选药物开展成药性研究。
技术介绍
腺苷酸基琥珀酸(盐)[Adenylosuccinicacid(Adenylosuccinate)，简称S-AMP]是一种促进胰岛素分泌，使Ⅱ型糖尿病患者胰岛细胞恢复正常的功能的天然腺苷类化合物[1]。前期研究中我们发现S-AMP是AMPK的一个激动剂，它的降脂活性高于降糖活性[2]。因此S-AMP可作为改善糖脂代谢紊乱新药的候选品来开展成药性研究。迄今为止，仅有Sigma公司销售S-AMP(纯度96%，价格约100元/mg，现停产)。目前急需研发一种降低药物研发成本且纯度增大的合成方法，降低S-AMP作为改善糖脂代谢紊乱新药的侯选品来开展成药性研究的成本。生物体内的腺苷酸基琥珀酸(盐)S-AMP合成反应是在腺苷酸基琥珀酸合成酶(AdSS)的催化下，利用肌苷酸(IMP)和L-天冬氨酸和三磷酸鸟苷(GTP)为原料合成S-AMP和二磷酸鸟苷酸(GDP)。由于IMP、L-天冬氨酸和GTP都是价格低廉的生物化工产品，发现活性高，稳定性好，因此寻找到易制备的AdSS就可开展S-AMP的大量合成。前期研究中发现古细菌PyrococcushorikoshiiOT3体内的AdSS(PhAdSS)符合这些要求[2,3]，然而什么样的合成条件能够高效合成S-AMP且得到纯度符合成药性研究要求的分离方法是建立生产工艺的要解决的关键科学问题。
技术实现思路
本专利技术为了解决现有腺苷酸基琥珀酸即S-AMP难以生产，其价格昂贵，难以保证其成药性研究的原料来源问题，提供了一种腺苷酸基琥珀酸或盐的制备方法，是利用酶促反应的S-AMP的小试合成及纯化技术，利用PhAdSS建立了S-AMP的小试合成体系，为建立S-AMP的工业化生产工艺奠定了基础。本专利技术由如下技术方案实现的：一种腺苷酸基琥珀酸或盐的制备方法，利用大肠杆菌表达体系pET-28-a载体表达N末端带有MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH即His-tag序列的PhAdSS，以此重组蛋白为催化剂催化肌苷酸IMP、L-天冬氨酸和三磷酸鸟苷GTP合成S-AMP和GDP，合成反应结束后，利用硅胶薄层层析分析产物中的成分，根据硅胶薄层层析结果进行硅胶柱层析分离纯化S-AMP，然后采用重结晶法进一步提高产物S-AMP的纯度。具体制备方法为：（1）催化剂的合成：a、构建表达质粒pET-28-a-PhAdSS：在浓度分别为1µg/ml的pET-28-a和pET-19-b-PhAdSS溶液中分别加入限制性内切酶NdeI和BamHI，37℃下反应2小时后用1%的琼脂糖凝胶电泳进行产物分离，100V电压下电泳40分钟后，从琼脂糖凝胶中回收pET-28-a和PhAdSS；将pET-28-a和回收的PhAdSS的cDNA混合，加入T4DNA连接酶反应溶液，37℃下反应16小时后，将反应生成的pET-28-a-PhAdSS质粒转化到大肠杆菌DH5α菌种内，37℃恒温箱中在含有50µg/ml硫酸卡那霉素的LB平板培养基上培养大肠杆菌12小时活化转化子，用含有50µg/ml硫酸卡那霉素的LB平板培养基37℃下培养转化子12小时，然后用质粒提取试剂盒提取质粒pET-28-a-PhAdSS；b、His-tagged-PhAdSS的表达和纯化：获得的质粒pET-28-a-PhAdSS转化到大肠杆菌表达菌种BL21ED3内，接种于自动诱导培养基上，37℃培养24小时，PhAdSS在大肠杆菌细胞内表达，培养结束后室温下离心回收大肠杆菌细胞，然后用上样缓冲液悬浮、离心去除沉淀，上清液用Ni-NTA蛋白质层析柱洗脱，回收纯化His-tagged-PhAdSS；（2）S-AMP合成反应：反应体系体积：0.5-5L；反应体系配方：20mMGTP；10mMIMP；11mLL-天冬氨酸；100µg/LHis-tagged-PhAdSS；MgCl24mM，用10M的NaOH调节反应体系pH为7.5；反应温度70℃，反应时间≥6小时，用硅胶薄层层析方法检测IMP转化率；（3）合成反应体系成分鉴定：合成反应结束后，用硅胶薄层层析分析产物中的成分，展开剂的配方v/v：异丙醇30%，正丁醇30%，浓度为6.25%的氨水40%；（4）S-AMP纯化：a、洗脱剂配方的确定：按照硅胶薄层层析法检测让S-AMP和GDP在硅胶层上迁移速率最大的展开剂配方；b、样品准备：合成反应完成后调节反应溶液pH值至2.9，室温下放置至少10小时，让过量的L-天冬氨酸析出；过滤去除固体后，上清液转移至蒸发皿内，在水浴锅上用蒸气浴法加热蒸发皿让样品体积浓缩至原来体积的10%，溶液中有不溶物生成过滤去除，或者将溶液完全蒸干，用不超过硅胶柱层析所进样体积的去离子水充分溶解析出的固形物，不溶物过滤去除；c、硅胶层析柱的制备：用10MNaOH水溶液调节样品溶液的pH至10，用分离样品总质量50倍的200-300目H硅胶进行层析，用无水乙醇湿法装柱得到硅胶层析柱，硅胶柱内硅胶填充高度低于20cm；d、上样：用分离样品总质量5倍的60-100目的上样硅胶吸附分离样品，然后将吸附样品的上样硅胶加入到层析柱内，高度低于0.5cm；e、洗脱：加入硅胶柱体积的1.5倍的流动相溶液，流动相溶液成分为v/v：乙醇60%、NH3浓度为6.25%的氨水40%；f、回收样品：室温下按照每瓶50ml回收流出液，回收的流出液用硅胶薄层层析法检测，展开极为v/v：异丙醇30%，正丁醇30%，NH3浓度为6.25%的氨水40%；g、回收纯化的S-AMP：合并S-AMP为单一成分的流出液，用10MNaOH水溶液调节pH值为10，旋转蒸发仪去除有机溶剂和氨，剩余水溶液用37%盐酸调节pH值至3，空气浴上蒸干，超纯水溶解获得的固体，过滤去除溶剂，空气浴或室温干燥；f、重结晶S-AMP：用体积比为60%乙醇作为溶剂，在37℃恒温箱内配成饱和溶液，降低温度至室温，然后置于-20℃冰箱内，静置10小时以上，S-AMP重结晶，在室温下抽滤去除液体，结晶室温干燥即得纯度为95%的成品。步骤（1）中所述PhAdSS在大肠杆菌细胞内表达培养结束后，培养液在离心力4000g离心20min回收大肠杆菌细胞；每升培养基内回收的大肠杆菌细胞用15ml的上样缓冲液悬浮，70℃恒温20分种后自然冷却至室温；4℃，12000g心20min去除沉淀；上清液流经柱体积10ml的Ni-NTA蛋白质层析柱后，用50ml的上样缓冲液流过Ni-NTA蛋白质层析柱洗去杂质，然后用25ml的洗脱液让His-tagged-PhAdSS从层析柱上洗脱出来，回收样品用SDS-PAGE检测纯度，用G250染色法测定蛋白质浓度；蛋白质层析在室温下实施；柱层析法纯化His-tagged-PhAdSS的流速为5mL/min；所述上样缓冲液为：20mM、pH8.0的Tris-HCl，500mMNaCl，20mM咪唑；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种腺苷酸基琥珀酸或盐的制备方法，其特征在于：利用大肠杆菌表达体系pET‑28‑a载体表达N末端带有MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH 即His‑tag序列的PhAdSS，以此重组蛋白为催化剂催化肌苷酸IMP、L‑天冬氨酸和三磷酸鸟苷GTP合成S‑AMP和GDP，合成反应结束后，利用硅胶薄层层析分析产物中的成分，根据硅胶薄层层析结果进行硅胶柱层析分离纯化S‑AMP，然后采用重结晶法进一步提高产物S‑AMP的纯度。

【技术特征摘要】
1.一种腺苷酸基琥珀酸或盐的制备方法，其特征在于：利用大肠杆菌表达体系pET-28-a载体表达N末端带有MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH即His-tag序列的PhAdSS，以此重组蛋白为催化剂催化肌苷酸IMP、L-天冬氨酸和三磷酸鸟苷GTP合成S-AMP和GDP，合成反应结束后，利用硅胶薄层层析分析产物中的成分，根据硅胶薄层层析结果进行硅胶柱层析分离纯化S-AMP，然后采用重结晶法进一步提高产物S-AMP的纯度。2.根据权利要求1所述的一种腺苷酸基琥珀酸或盐的制备方法，其特征在于：具体制备方法为：（1）催化剂的合成：a、构建表达质粒pET-28-a-PhAdSS：在浓度分别为1µg/ml的pET-28-a和pET-19-b-PhAdSS溶液中分别加入限制性内切酶NdeI和BamHI，37℃下反应2小时后用1%的琼脂糖凝胶电泳进行产物分离，100V电压下电泳40分钟后，从琼脂糖凝胶中回收pET-28-a和PhAdSS；将pET-28-a和回收的PhAdSS的cDNA混合，加入T4DNA连接酶反应溶液，37℃下反应16小时后，将反应生成的pET-28-a-PhAdSS质粒转化到大肠杆菌DH5α菌种内，37℃恒温箱中在含有50µg/ml硫酸卡那霉素的LB平板培养基上培养大肠杆菌12小时活化转化子，用含有50µg/ml硫酸卡那霉素的LB平板培养基37℃下培养转化子12小时，然后用质粒提取试剂盒提取质粒pET-28-a-PhAdSS；b、His-tagged-PhAdSS的表达和纯化：获得的质粒pET-28-a-PhAdSS转化到大肠杆菌表达菌种BL21ED3内，接种于自动诱导培养基上，37℃培养24小时，PhAdSS在大肠杆菌细胞内表达，培养结束后室温下离心回收大肠杆菌细胞，然后用上样缓冲液悬浮、离心去除沉淀，上清液用Ni-NTA蛋白质层析柱洗脱，回收纯化His-tagged-PhAdSS；（2）S-AMP合成反应：反应体系体积：0.5-5L；反应体系配方：20mMGTP；10mMIMP；11mLL-天冬氨酸；100µg/LHis-tagged-PhAdSS；MgCl24mM，用10M的NaOH调节反应体系pH为7.5；反应温度70℃，反应时间≥6小时，用硅胶薄层层析方法检测IMP转化率；（3）合成反应体系成分鉴定：合成反应结束后，用硅胶薄层层析分析产物中的成分，展开剂的配方v/v：异丙醇30%，正丁醇30%，浓度为6.25%的氨水40%；（4）S-AMP纯化：a、洗脱剂配方的确定：按照硅胶薄层层析法检测让S-AMP和GDP在硅胶层上迁移速率最大的展开剂配方；b、样品准备：合成反应完成后调节反应溶液pH值至2.9，室温下放置至少10小时，让过量的L-天冬氨酸析出；过滤去除固体后，上清液转移至蒸发皿内，在水浴锅上用蒸气浴法加热蒸发皿让样品体积浓缩至原来体积的10%，溶液中有不溶物生成过滤去除，或者将溶液完全蒸干，用不超过...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢勇，王楠，赵京凤，成钟，赵晓宏，杨润梅，吴崇明，郭鹏，蔡大勇，薛健，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11