区分免疫和感染动物H7亚型禽流感疫苗株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了区分免疫和感染动物H7亚型禽流感疫苗株及其制备方法和应用，高致病H7禽流感不仅给畜牧业带来巨大经济损失，而且严重威胁公共卫生学的安全。虽然常规的H7亚型禽流感全病毒灭活疫苗效果确实，价格低廉，应用面广等优点，但在血清学上无法区分免疫和感染动物，给禽流感的监测和净化带来巨大障碍。本发明专利技术用首次B型流感的NA作为标签，成功建立一种构建区分免疫和感染H7亚型禽流感疫苗株的方法。该发明专利技术对H7亚型禽流感的防控和净化具有重要的应用价值和公共卫生学意义。

Differentiation and vaccination of H7 subtype avian influenza vaccine strain and its preparation and Application

The invention discloses the differentiation of H7 subtype avian influenza vaccine strain and its preparation methods and applications. The highly pathogenic H7 avian influenza not only brings huge economic losses to the animal husbandry, but also seriously threatens the safety of public health. Although the conventional H7 subtype inactivated avian influenza virus inactivated vaccine has the advantages of low price and wide application, it can not distinguish the immune and infected animals from the serology and bring great obstacles to the monitoring and purification of avian influenza. The invention uses the NA of the first influenza B as a label, and successfully establishes a method for constructing a vaccine strain that differentiating immunity and infection of H7 subtype avian influenza. The invention has important application value and public health significance for the prevention and control and purification of H7 subtype avian influenza.

【技术实现步骤摘要】
区分免疫和感染动物H7亚型禽流感疫苗株及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程疫苗
，涉及一种制备区分免疫和感染H7亚型禽流感疫苗株的方法及应用。
技术介绍
禽流感病毒属于正黏病毒科，流感病毒属。流感病毒根据抗原性不同可分为A，B，C型，其中A型流感宿主广泛(包括禽类，人，猪等)致病力较强危害巨大。B型流感仅感染人和海豹，致病力相对较低。C型流感病毒，仅在人与猪中发现。A型和B型流感的基因组可以分为PB2,PB1,PA,NP,HA,NA,M，NS共8个基因片段。宿主被感染后，可以对HA，NA，M1和NP产生大量抗体。其中HA可以直接诱导主要中和抗体。以往的研究发现A型和B型病毒诱导的针对HA，NA，M1和NP的四种主要抗体在血清学上无交叉反应性。根据A型流感病毒粒子的表面囊膜蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶NA不同，将A型流感分为众多亚型(HnNn)。其中HA有18种亚型，NA有11种亚型。不同亚型HA蛋白间序列同源性在40％-80％之间(AirGM.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1981,78(12):7639.NobusawaE,etal.Virology,1991,182(2):475-485)。B型流感没有亚型之分，各个毒株基因相似性较高。根据HA的抗原性和基因型不同，B型流感病毒目前仅分为两个群，分别为Victoria群(依据B/Victoria/2/1987命名)和Yamagata群(依据B/Yamagata/16/1988命名)。禽类中几乎存在所有A型流感的各种亚型，在病毒的储存和进化中伴有重要作用。禽流感全球肆虐给养禽业带来巨大经济损失，随着禽流感病毒对人类的逐渐适应，禽流感感染人的事例也逐渐增多。相比季节性型人流感，禽流感感染人具有发病严重，死亡率高的特征，严重威胁公共卫生安全。在众多禽流感亚型中，高致病性H7亚型禽流感危害巨大，不仅造成巨大经济损失而且可以直接感染人。高致病性H7禽流感可以在数天内导致家禽100％死亡，而且可以直接感染人。人感染后症状严重，死亡率高。目前疫苗是防控禽流感最有效的方法之一。以鸡胚高度适应株PR8内部基因为背景，外部基因(HA，NA)替换为针对流行株的构建的疫苗株具有安全，有效和廉价等优点，在中国使用最为广泛，在禽流感疫苗的防控中起到重要作用。但是这种全病毒灭活疫苗不能在血清学上区分免疫动物和感染动物，给禽流感病毒的监测和净化带来巨大障碍。由于HA蛋白负责与受体结合，协助病毒入侵细胞；NA蛋白是破坏HA于受体的结合，协助病毒从细胞释放。因此保持HA-NA之间的功能平衡(HA-NA的匹配性)，直接影响流感病毒的复制能力，生长特性(MitnaulLJ,MatrosovichMN,CastrucciMR,etal.BalancedHemagglutininandNeuraminidaseActivitiesAreCriticalforEfficientReplicationofInfluenzaAVirus[J].JournalofVirology,2000,74(13):6015-20.)。因此选择匹配度较好的HA和NA是研制优异疫苗株的关键之一(MurakamiS,etal.GrowthDeterminantsforH5N1InfluenzaVaccineSeedVirusesinMDCKCells[J].JournalofVirology,2008,82(21):10502.)。为了保证疫苗株HA和NA有较好的匹配度，通常情况下HA和NA基因都来源于同一株病毒。引入异源的NA可能打破HA-NA之间的功能性平衡，从而降低病毒的生长和复制能力，甚至导致重组病毒无法救获。一般而言，这样的风险会随着引入NA基因相似性(与同源NA相比)降低而不断增加。不同亚型的NA之间的替换，会影响获救重组病毒的复制和生长等生物学特性。这也是自然界里为什么只存在少数优势亚型组合(如常见H9N2，H5N1，H7N9等)而不是HA-NA的随机组合(如罕见H9N1，H5N9等)(WagnerRetal，Functionalbalancebetweenhaemagglutininandneuraminidaseininfluenzavirusinfections[J].ReviewsinMedicalVirology,2002,12(3):159)。Rudnevaetal用N1基因和不同亚型HA组合，发现获救的H3，H4，H10和H13的重组病毒在鸡胚上的生长特性比其野生型的病毒更差(RudnevaIAetal.InfluenzaAvirusreassortantswithsurfaceglycoproteingenesoftheavianparentviruses:effectsofHAandNAgenecombinationsonvirusaggregation.[J].ArchivesofVirology,1993,133(3-4):437-450.由于B型NA蛋白和A型差异很大(相似性<30％)，引入B型NA获得A/B型嵌合病毒的成功几率很小。此外获救的A/B型NA嵌合病毒可能存在生长性能的缺陷，需要在体外连续传代适应。而连续传代有引起抗原变异的风险，从而导致制备的疫苗株的抗原性与原有的野生流行株有较大差异。截止目前，含有H7亚型HA和含有B型NA的嵌合病毒没有任何成功救获的报道。现有的H7亚型全病毒灭活疫苗虽然具有免疫效果确实，价格低廉等的优点，但是无法在血清学上区分免疫动物和感染动物(DIVA)严重影响了对病毒流行性的监测，阻碍对H7亚型禽流感在养殖场的彻底净化，给公共卫生和食品安全带来持续风险。因此，制备出能够区分免疫和感染的H7亚型新型禽流感疫苗株为目前所需。
技术实现思路
为了解决上述存在的问题，本申请首次用B型流感病毒的NA基因作为标记，研制出一种制备区分免疫和感染H7新型禽流感疫苗的方法。此外本专利技术通过对NS基因的部分缺失和HA的致弱修饰使得获救的疫苗株的安全性明显优于普通的疫苗株。因此本专利技术提供制备安全有效，生产成本低而且可以通过血清学方法区分免疫和感染动物的H7禽流感疫苗的方法，具有重要的应用价值和突出的公共卫生安全意义。本专利技术的目的在于提供一种区分免疫和感染的H7亚型禽流感疫苗株及其应用。本专利技术的另一目的在于提供一种制备区分免疫和感染的H7亚型禽流感疫苗株方法。本专利技术所采取的技术方案是：标签基因序列在制备区分免疫和感染A型流感病毒的H7亚型禽流感疫苗株中的应用，所述标签基因序列含有编码B型流感病毒NA蛋白胞外区氨基酸序列的DNA序列，或者含有编码与该胞外区氨基酸序列具有至少90％同源性、或至少92％同源性、或至少95％同源性、或至少98％同源性氨基酸序列的DNA序列；或者，所述标签基因序列含有B型流感病毒NA基因中编码胞外区氨基酸序列的DNA序列，或者含有与该DNA序列具有至少90％同源性、或至少92％同源性、或至少95％同源性、或至少98％同源性的序列；或者，所述标签基因序列为编码B型流感病毒NA蛋白的DNA序列，或者为编码与该本文档来自技高网...

【技术保护点】
标签基因序列在制备区分免疫和感染A型流感病毒的H7亚型禽流感疫苗株中的应用，所述标签基因序列含有编码B型流感病毒NA蛋白胞外区氨基酸序列的DNA序列，或者含有编码与该胞外区氨基酸序列具有至少90％同源性、或至少92％同源性、或至少95％同源性、或至少98％同源性氨基酸序列的DNA序列；或者，所述标签基因序列含有B型流感病毒NA基因中编码胞外区氨基酸序列的DNA序列，或者含有与该DNA序列具有至少90％同源性、或至少92％同源性、或至少95％同源性、或至少98％同源性的序列；或者，所述标签基因序列为编码B型流感病毒NA蛋白的DNA序列，或者为编码与该NA蛋白氨基酸序列具有至少90％同源性、或至少92％同源性、或至少95％同源性、或至少98％同源性氨基酸序列的DNA序列；或者，所述标签基因序列为B型流感病毒NA基因的DNA序列，或者为与该DNA序列具有至少90％同源性、或至少92％同源性、或至少95％同源性、或至少98％同源性的序列。

【技术特征摘要】
1.标签基因序列在制备区分免疫和感染A型流感病毒的H7亚型禽流感疫苗株中的应用，所述标签基因序列含有编码B型流感病毒NA蛋白胞外区氨基酸序列的DNA序列，或者含有编码与该胞外区氨基酸序列具有至少90％同源性、或至少92％同源性、或至少95％同源性、或至少98％同源性氨基酸序列的DNA序列；或者，所述标签基因序列含有B型流感病毒NA基因中编码胞外区氨基酸序列的DNA序列，或者含有与该DNA序列具有至少90％同源性、或至少92％同源性、或至少95％同源性、或至少98％同源性的序列；或者，所述标签基因序列为编码B型流感病毒NA蛋白的DNA序列，或者为编码与该NA蛋白氨基酸序列具有至少90％同源性、或至少92％同源性、或至少95％同源性、或至少98％同源性氨基酸序列的DNA序列；或者，所述标签基因序列为B型流感病毒NA基因的DNA序列，或者为与该DNA序列具有至少90％同源性、或至少92％同源性、或至少95％同源性、或至少98％同源性的序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述H7亚型禽流感疫苗株中还含有H7亚型HA基因或突变的H7亚型HA基因；所述突变的H7亚型HA基因能够将野生型HA蛋白中的氨基酸序列VPKGKRTARGLF突变为VPSSRSRGLF或VPKGRGLF。3.根据权利要求1任一所述的应用，其特征在于，所述B型流感病毒包括Victoria群和Yamagata群的B型流感病毒。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述B型流感病毒具体包括但不限于病毒株B/Massachusetts/2/2012，B/Brisbane/60/2008，B/Yamagata/16/1988，B/Malaysia/2506/04。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述标签基因序列两端还含有包装信号序列，所述包装信号为H1亚型NA的包装信号，或者为与H1亚型NA的包装信号具有至少80％同源性、或至少85％同源性、或至少90％同源性、或至少95％同源性的包装信号序列。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述标签基因序列两端还含有包装信号序列，其中5′端包装信号序列包括非编区序列、胞内区序列、跨膜区序列。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，胞内区序列编码5～7个氨基酸，氨基酸序列位于胞内。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，跨膜区序列编码24～32个氨基酸，氨基酸序列位于跨膜区。9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述标签基因序列的5′端包装信号序列为SEQIDNO:3，或者为与SEQIDNO:3具有至少80％同源性、或至少85％同源性、或至少90％同源性、或至少95％同源性的序列。10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述标签基因序列两端还含有包装信...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋家升，
申请(专利权)人：宋家升，
类型：发明
国别省市：浙江,33