单亚基RNA聚合酶、其纯化方法及在RNA合成中的应用技术

本发明专利技术公开单亚基RNA聚合酶、其纯化方法及在RNA合成中的应用。所述的单亚基RNA聚合酶，为来自φKMV类噬菌体的单亚基RNA聚合酶；或来自与所述φKMV类噬菌体的单亚基RNA聚合酶的蛋白质序列同源性高于25%并含有如序列表SEQ ID NO.1所示的特征氨基酸序列，且总氨基酸序列数目在800~830之间的其他噬菌体单亚基RNA聚合酶。经研究发现本发明专利技术提供的RNA聚合酶与现有的RNA工具酶亲缘关系较远，其转录效率较高。在与现有T7 RNA聚合酶和Syn5 RNA聚合酶相比较时，针对后二者在合成富含稳定高级结构RNA时产物复杂的问题，本发明专利技术单亚基RNA聚合酶显示出转录产物均一的显著优点。

Single subunit RNA polymerase, its purification method and its application in RNA synthesis

The invention discloses a single subunit RNA polymerase, its purification method and its application in RNA synthesis. The single subunit RNA polymerase is the single subunit RNA polymerase from Phi class KMV phage, or the homology of the protein sequence from the single subunit RNA polymerase of the phi phage class KMV phage is higher than 25% and contains the sequence of characteristic amino acids as shown in the sequence list SEQ ID NO.1, and the number of total amino acid sequences is between 800~830. His phage single subunit RNA polymerase. It is found that the RNA polymerase provided by the present invention is far from the existing RNA tool enzyme, and its transcription efficiency is relatively high. In comparison with the existing T7 RNA polymerase and Syn5 RNA polymerase, in order to solve the complex problems of the latter two in the synthesis of stable high structure RNA products, the invention of the single subunit RNA polymerase shows the significant advantage of the homogeneity of the transcriptional products.

【技术实现步骤摘要】
单亚基RNA聚合酶、其纯化方法及在RNA合成中的应用
本专利技术属于微生物核酸代谢酶研究领域，具体涉及单亚基RNA聚合酶、其纯化方法及在RNA合成中的应用。
技术介绍
RNA(核糖核酸)是所有生物遗传信息传递的最重要的一类大分子，同时在生物体内也扮演着多种多样的调控角色。近年来RNA研究已成为生物学研究中最热门的领域之一。RNA主要包括mRNA、tRNA、rRNA等大类，随着近些年生物学技术的快速发展，科学家们发现一些新颖的RNA如microRNA(miRNA)(Chengetal.,2005)、longnon-codingRNA(lncRNA)(Shietal.,2016)、nanostructureRNA(Gearyetal.,2014)等也对生物体发挥着至关重要的作用。设计好的RNA序列可以编码，并可被翻译为任何蛋白质，因此理论上可以替代现存的任何蛋白质药物；且RNA结构相较蛋白质结构要简单得多，容易构建。RNA作为药物的另一个巨大优点是代谢快、半衰期短、翻译产生蛋白质后迅速被降解，相比基因治疗(改变DNA产生永久不可逆的效果)副作用几乎不必考虑。小RNA还可以通过翻译以外的机制如RNA干扰(RNAi)以及RNA指导的基因编辑(CRISPRgRNA)治疗疾病。随着RNA导入细胞方法的完善，以及各种增强稳定性及减少免疫反应的RNA修饰方法的发现，RNA治疗在美国已成为最热门的药物研究方向。大型制药公司如Merck、AstraZeneca、Shire等纷纷投入力量重点开发RNA药物。正是由于这些围绕RNA的研究和应用相继大量开展，对RNA体外合成在质和量两方面提出了很高的挑战。而RNA的体外制备恰恰是RNA研究和应用的最大瓶颈。由于RNA本身不稳定的性质，RNA的化学合成远不如DNA合成高效，化学合成RNA仅限于小RNA(几到几十个核苷酸长度)，随着RNA长度的增加，化学合成的成本迅速上升。RNA长度达一百个核苷酸以上化学合成法已不再适用(Galloetal.,2005)，而编码蛋白质的RNA通常都长达几千个核苷酸。目前制备长RNA唯一的方法是体外酶法合成，酶法合成是指在体外以DNA双链为模板利用RNA聚合酶进行转录合成RNA的一种方法，目前这种利用DNA依赖的RNA聚合酶进行体外RNA转录的技术广泛应用于杂交分析、晶体结构研究、生物化学和遗传研究等(Kessleretal.,2017；Romanienkoetal.,2016)。这一方法利用一种简单微生物大肠杆菌噬菌体T7的RNA合成机器——单亚基的T7RNA聚合酶，在体外从带有T7启动子序列的DNA模版上反复转录产生大量所需的RNA。虽然大部分生物自身拥有RNA聚合酶，但是大多都具有复杂的亚基组成和调控机制，不适合用作体外合成RNA的酶工具，只有来源于某些最小最简单的病毒，如T7噬菌体的单亚基RNA聚合酶适合这类用途。自然界中被鉴定的这类单亚基RNA聚合酶只有来源于噬菌体T7、T3和SP6三种，后两种在序列和功能上与T7RNA聚合酶高度相似因而基本被摒弃，因而对于RNA合成这样一个重要的生物技术人们现在只有一个酶工具可用。T7RNA聚合酶于上世纪70年代被鉴定，当时人们所知的噬菌体只有寥寥几种，其并不是一个最理想的RNA合成工具酶。它的最主要缺点包括提前终止、延伸性能弱、产物末端不均一、必须以一种核苷酸起始、对修饰核苷酸掺入效率低、对产物RNA高级结构敏感等等(ChamberlinandRing,1973；Lyakhovetal.,1998)，以致很多情况下所需的RNA无法有效合成，因而选择T7作为体外合成RNA的标准酶具有很大的随机性。在随后的数十年中，人们对T7RNA聚合酶进行了大量的优化和改造，相关论文和专利不计其数，然而这个酶并不是天然为RNA体外合成而设，其主要缺点越来越成为RNA这一热门研究和应用领域的限制因素。海洋蓝细菌噬菌体Syn5(Popeetal.,2007)RNA聚合酶，具有与T7RNA聚合酶基因有微弱相似性的基因。经分子克隆，表达纯化和酶学性质分析，该基因产物确实是一个新的RNA聚合酶(Zhuetal.,2013)。尽管在众多性能方面，尤其是T7系统的几个薄弱环节，Syn5RNA聚合酶显示出明显的优势，但对于体外转录富含高级结构的RNA，Syn5RNA聚合酶和T7RNA聚合酶一样都具有转录产物不均一的缺点，这无疑对更多新颖的RNA聚合酶的研究和开发带来需求和挑战。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的问题，提供新的单亚基RNA聚合酶，可用于体外RNA的合成，与现有的T7、SP6和P60类RNA聚合酶存在显著差异，为RNA研究与应用提供一种有效的候选酶工具。本专利技术的另一目的是提供所述单亚基RNA聚合酶在体外转录合成RNA中的应用。本专利技术的另一目的是提供所述单亚基RNA聚合酶的纯化方法，可获得纯度较高的KP34RNA聚合酶。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种单亚基RNA聚合酶，来自类噬菌体的单亚基RNA聚合酶；或来自与所述类噬菌体的单亚基RNA聚合酶的蛋白质序列同源性高于25％并含有如序列表SEQIDNO.1所示的特征氨基酸序列，且总氨基酸序列数目在800～830之间的其他噬菌体的单亚基RNA聚合酶；其中，序列表SEQIDNO.1中每个Xaa独立代表任意氨基酸；所述单亚基RNA聚合酶的蛋白质氨基端均含有组氨酸标签，所述组氨酸的编码碱基序列如序列表SEQIDNO.2所示；或者，所述单亚基RNA聚合酶的蛋白质氨基端均含有FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标签中的一种；所述标签与单亚基RNA聚合酶之间由0～10个氨基酸组成保持柔性的肽段连接。根据基因排列及相似性进行的分类研究发现，噬菌体T7、T3与SP6亲缘关系较近，因而它们的RNA聚合酶性质相似；而以Syn5为代表的海洋短尾噬菌体则与上述噬菌体进化关系较远，反映在Syn5RNA聚合酶的大小、序列和功能上也与T7RNA聚合酶差异较大，因而形成新的RNA合成工具和系统。类噬菌体与上述短尾噬菌体亲缘关系更远，成员间异质性较大，推测其RNA聚合酶转录体系与已知的噬菌体转录体系差异很大。T7类、SP6类、P60类(含Syn5)和类的亲缘关系参见图1(Druliskawaetal.,2011)。本专利技术单亚基RNA聚合酶排除了T7、SP6和P60类RNA聚合酶，T7及SP6类RNA聚合酶含有883(+/-15)个氨基酸，P60类RNA聚合酶含有779(+/-15)个氨基酸。所述如序列表SEQIDNO.1所示的特征氨基酸序列，经研究发现，该序列为来自类噬菌体KP34、VP93、RSB1、的RNA聚合酶同源序列，为RNA聚合酶发挥催化活性的关键氨基酸序列。在所述单亚基RNA聚合酶的蛋白质氨基端连接标签，利于后续进行亲和层析纯化得到不含RNA酶污染的应用级蛋白质。所述保持柔性的肽段可采用现有富含甘氨酸或丝氨酸的串联组合，例如Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser等，其中也可包含蛋白酶切位点如Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser，它们的作用是使所关联的标签充本文档来自技高网...

【技术保护点】
单亚基RNA聚合酶，其特征在于，来自φKMV类噬菌体的单亚基RNA聚合酶；或来自与所述φKMV类噬菌体的单亚基RNA聚合酶的蛋白质序列同源性高于25%并含有如序列表SEQ ID NO. 1所示的特征氨基酸序列，且总氨基酸序列数目在800~830之间的其他噬菌体的单亚基RNA聚合酶；其中，序列表SEQ ID NO. 1中每个Xaa独立代表任意氨基酸；所述单亚基RNA聚合酶的蛋白质氨基端均含有组氨酸标签，所述组氨酸的编码碱基序列如序列表SEQ ID NO. 2所示；或者，所述单亚基RNA聚合酶的蛋白质氨基端均含有FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标签中的一种；所述标签与单亚基RNA聚合酶之间由0~10个氨基酸组成保持柔性的肽段连接。

【技术特征摘要】
1.单亚基RNA聚合酶，其特征在于，来自φKMV类噬菌体的单亚基RNA聚合酶；或来自与所述φKMV类噬菌体的单亚基RNA聚合酶的蛋白质序列同源性高于25%并含有如序列表SEQIDNO.1所示的特征氨基酸序列，且总氨基酸序列数目在800~830之间的其他噬菌体的单亚基RNA聚合酶；其中，序列表SEQIDNO.1中每个Xaa独立代表任意氨基酸；所述单亚基RNA聚合酶的蛋白质氨基端均含有组氨酸标签，所述组氨酸的编码碱基序列如序列表SEQIDNO.2所示；或者，所述单亚基RNA聚合酶的蛋白质氨基端均含有FLAG标签、HA标签、SBP标签、Avi标签、Nus标签、V5标签中的一种；所述标签与单亚基RNA聚合酶之间由0~10个氨基酸组成保持柔性的肽段连接。2.根据权利要求1所述的单亚基RNA聚合酶，其特征在于，为φKMV类噬菌体KP34的RNA聚合酶，所述标签与KP34的RNA聚合酶之间的肽段由10个氨基酸组成；在KP34的RNA聚合酶基因5’末端前30个碱基处带有所述如序列表SEQIDNO.2所示的组氨酸标签。3.权利要求1或2所述的单亚基RNA聚合酶在体外转录合成RNA中的应用。4.利用权利要求1或2所述的单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.获得编码所需RNA的DNA转录模板；S2.加入所述单亚基RNA聚合酶，转录模板，pH7.9Tris-HCl，氯化镁，亚精胺，DTT，四种核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，RNA酶抑制剂，无机焦磷酸酶，DEPC水混合后进行体外转录反应。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2所述转录反应的时间为1~2h。6.权利要求4所述方法在体外转录合成富含二级结构的RNA中的应用。7.权利要求1或2所述单亚基RNA聚合酶的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）镍柱亲和层析：将所述噬菌体的菌体裂解上清液通过镍柱，带所述标签的蛋白与镍柱结合，加入由低浓度到高浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱斌，吴慧，陆雪玲，夏恒，黄锋涛，
申请(专利权)人：武汉核圣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42