一种提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基及其应用方法技术

本发明专利技术提供一种提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基，该培养基的组分包括：甘露糖12‑30g、海藻糖5‑10g、酪蛋白胨3‑6g、无水乙酸钠3‑6g、牛肉浸膏粉5‑10g、乙酸钾3‑6g、无水氯化钙1.5‑4.0g、硫酸镁0.1‑0.8g、硫酸锰0.1‑0.5g、L‑半胱氨酸盐酸盐0.1‑1g、0.6‑1.2mL吐温‑80和蒸馏水1000mL。利用本发明专利技术提供的耐冻培养基，特别是利用本发明专利技术的冻干保护方法，能够获得较高的保加利亚乳杆菌冻干存活率，且保藏期较长，存活率不易降低。

Medium for improving freezing tolerance of Lactobacillus bulgaricus and its application method

The present invention provides a medium for improving the frost resistance of Lactobacillus bulgaricus, which includes mannose 12 30g, trehalose 5 10g, casein peptone 3 6G, anhydrous sodium acetate 3 6G, beef extract 5 10g, potassium 3 acetate 6G, anhydrous calcium chloride 1.5 4.0g, Magnesium Sulfate 0.1 0.8g, 0.1 sulfate manganese sulfate 0.5g 0.5g 0.5g , L cysteine hydrochloride 0.1, 1g, 0.6, 1.2mL, Twain, 80 and distilled water 1000mL. The freeze-drying survival rate of Lactobacillus bulgaricus can be obtained by using the frozen culture medium provided by the invention, especially by using the method of freezing dry protection of the invention, and the preservation period is longer and the survival rate is not easy to be reduced.

【技术实现步骤摘要】
一种提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基及其应用方法
本专利技术属于保加利亚乳杆菌制品生产
，涉及一种提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基制备及其应用方法。
技术介绍
保加利亚乳杆菌分类学上属于乳杆菌属、德氏乳杆菌菌种的德氏乳杆菌保加利亚亚种。由于它产酸能力极强，并且可产生天然的抗菌物质及风味物质，被广泛应用于医药和发酵食品领域。真空冷冻干燥技术是制备益生菌菌粉的最常用、最有效的方法之一，由于在冻干过程中会对乳酸菌造成机械损伤、溶质损伤、细胞膜损伤等一系列影响，使得乳酸菌在冻干过程中的存活率受到了极大地威胁。而冻干存活率则与菌株遗传物质、菌株形态、细胞膜结构、所处的生长阶段、培养基成分、培养条件、保护剂的选择、冻干条件等一系列因素有关。冻干保护剂的优化是人们最常用的提高菌株冻干存活率的方法，但复合保护剂添加量越大，单位质量菌粉活菌数越低，而通过改变培养基成分可以改变菌株自身的耐冻能力，可以避免或减少菌体在冻干过程中的损伤，在提高冻干存活率和菌粉活菌数的同时，也能够提高保加利亚乳杆菌的保存稳定性。中国专利CN101524150公开了一种乳酸菌保护剂，由脱脂奶粉、甘油，以及选自海藻糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、低聚帕拉金糖的一种或一种以上物质组成。中国专利CN102604833A公开了冻干保护剂由蔗糖、乳糖、乳清粉和海藻糖中的一种或几种组成。虽然这些冻干保护剂能够对菌种起一定保护作用，但存活率在较短的时间内有明显降低，不能满足对乳杆菌长时间储存的要求。目前还没有提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基的相关记载。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基及其应用方法，该培养基能够显著提高保加利亚乳杆菌的耐冻性，解决了保加利亚乳杆菌在冻干过程中冻干存活率不高，菌粉活菌数低，以及常温保存稳定性差的问题。本专利技术的技术方案包括以下步骤：一种提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基的配方包括以下组分：甘露糖12-30g、海藻糖5-10g、酪蛋白胨3-6g、无水乙酸钠3-6g、牛肉浸膏粉5-10g、乙酸钾3-6g、无水氯化钙1.5-4.0g、硫酸镁0.1-0.8g、硫酸锰0.1-0.5g、L-半胱氨酸盐酸盐0.1-1g、0.6-1.2mL吐温-80和蒸馏水1000mL。作为一种具体实施方案，所述的一种提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基配方包括以下组分：甘露糖20g、海藻糖8g、酪蛋白胨4g、无水乙酸钠4g、牛肉浸膏粉8g、乙酸钾4g、无水氯化钙2.4g、硫酸镁0.4g、硫酸锰0.1g、L-半胱氨酸盐酸盐0.6g、0.8mL吐温-80和蒸馏水1000mL。作为一种具体实施方案，所述的一种提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基配方包括以下组分：甘露糖30g、海藻糖10g、酪蛋白胨6g、无水乙酸钠6g、牛肉浸膏粉10g、乙酸钾5g、无水氯化钙3g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.1g、L-半胱氨酸盐酸盐0.6g、1mL吐温-80和蒸馏水1000mL。本专利技术还提供一种所述的培养基的制备方法，包括以下步骤：(1)将称取的无水氯化钙、硫酸镁、硫酸锰及L-半胱氨酸盐酸盐分别溶解于50mL的蒸馏水中；(2)将称取的甘露糖、海藻糖、酪蛋白胨、牛肉浸膏粉、无水乙酸钠、乙酸钾和吐温-80溶解于800mL的蒸馏水中，加热溶解；(3)将(1)中所得的4种溶液加入(2)中，搅拌均匀后，调节pH至7.2-7.4，然后于121℃灭菌15-20min。即可得到提高保加利亚乳杆菌菌粉活菌数的培养基。作为一种具体实施方案，本专利技术还提供一种提高保加利亚乳杆菌菌粉活菌数的培养基的应用方法，包括以下步骤：将活化后的保加利亚乳杆菌菌种按照4％的接种量接入提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基中，于38℃厌氧培养8-12h，所得发酵液于12000rpm离心20-30min，弃去上清液，得到保加利亚乳杆菌菌泥，向菌泥中加入2倍重量的含有200-300g/L脱脂奶粉和200-300g/L麦芽糖的冻干保护剂，混合均匀后放入冻干机中进行冷冻干燥，得到保加利亚乳杆菌菌粉。本专利技术所述的提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基中，以甘露糖替换原有碳源葡萄糖，并且添加了抗冻因子海藻糖，以此制得的耐冻培养基可以使保加利亚乳杆菌的菌粉活菌数、冻干存活率以及常温保存稳定性得到显著提升。采用本专利技术方法制备的保加利亚乳杆菌菌粉活菌数可达到7.50×1010cfu/g以上，冻干存活率达到80％以上，常温保存1年的存活率为80％以上，而现有方法制备的保加利亚乳杆菌菌粉活菌数最高为2.20×1010cfu/g，冻干存活率最高为35％，常温保存1年的存活率最高为60％。本专利技术提供了提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基，其优异之处在于：1)本专利技术提供的耐冻培养基，各成分对保加利亚乳杆菌有益，导致培养基中活菌数高；2)本专利技术提供的耐冻培养基，赋予保加利亚乳杆菌长期的耐冻能力，导致长期冻干存活率高。利用本专利技术提供的耐冻培养基，特别是利用本专利技术的冻干保护方法，能够获得较高的保加利亚乳杆菌冻干存活率，且保藏期较长，存活率不易降低。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明。实施例1：(1)将准确称取的3g无水氯化钙、0.5g硫酸镁、0.1g硫酸锰及0.6g的L-半胱氨酸盐酸盐分别溶解于50mL的蒸馏水中；(2)将准确称取的30g甘露糖、10g海藻糖、6g酪蛋白胨、10g牛肉浸膏粉、3g无水乙酸钠、5g乙酸钾和1mL吐温-80溶解于800mL的蒸馏水中，加热溶解；(3)将(1)中所得的4种溶液加入(2)中，搅拌均匀后，调节pH至7.2-7.4，然后于121℃灭菌15-20min。即可得到提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基。将活化后的保加利亚乳杆菌菌种按照4％的接种量分别接入保加利亚乳杆菌耐冻培养基和内蒙古双奇药业股份有限公司保加利亚乳杆菌生产用培养基(对照组)中，于38℃厌氧培养8-12h，所得发酵液于12000rpm离心20-30min，弃去上清液，得到保加利亚乳杆菌菌泥，向菌泥中加入2倍重量的含有200-300g/L脱脂奶粉和200-300g/L麦芽糖的冻干保护剂，混合均匀后放入冻干机中进行冷冻干燥，得到保加利亚乳杆菌菌粉，菌粉活菌数为7.82×1010cfu/g(对照为2.10×1010cfu/g)，冻干存活率为84.50％(对照组为32.50％)，常温保存1年的存活率为86.20％(对照组为56.66％)。实施例2：(1)将准确称取的2.4g无水氯化钙、0.4g硫酸镁、0.1g硫酸锰及0.6g的L-半胱氨酸盐酸盐分别溶解于50mL的蒸馏水中；(2)将准确称取的20g甘露糖、8g海藻糖、4g酪蛋白胨、8g牛肉浸膏粉、2.4g无水乙酸钠、4g乙酸钾和0.8mL吐温-80溶解于800mL的蒸馏水中，加热溶解；(3)将(1)中所得的4种溶液加入(2)中，搅拌均匀后，调节pH至7.2-7.4，然后于121℃灭菌15-20min。即可得到提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基。将活化后的保加利亚乳杆菌菌种按照4％的接种量分别接入保加利亚乳杆菌耐冻培养基和内蒙古双奇药业股份有限公司保加利亚乳杆菌生产用培养基(对照组)中，于38℃厌氧培养8-12h，所得发酵液于12000rpm离心20-30min，弃去上清液，得到保加利亚乳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基，其特征在于：该培养基的配方包括以下组分：甘露糖12‑30g、海藻糖5‑10g、酪蛋白胨3‑6g、无水乙酸钠3‑6g、牛肉浸膏粉5‑10g、乙酸钾3‑6g、无水氯化钙1.5‑4.0g、硫酸镁0.1‑0.8g、硫酸锰0.1‑0.5g、L‑半胱氨酸盐酸盐0.1‑1g、0.6‑1.2mL吐温‑80和蒸馏水1000mL。

【技术特征摘要】
1.一种提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基，其特征在于：该培养基的配方包括以下组分：甘露糖12-30g、海藻糖5-10g、酪蛋白胨3-6g、无水乙酸钠3-6g、牛肉浸膏粉5-10g、乙酸钾3-6g、无水氯化钙1.5-4.0g、硫酸镁0.1-0.8g、硫酸锰0.1-0.5g、L-半胱氨酸盐酸盐0.1-1g、0.6-1.2mL吐温-80和蒸馏水1000mL。2.根据权利要求1所述的一种提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基，其特征在于：所述的培养基配方包括以下组分：甘露糖20g、海藻糖8g、酪蛋白胨4g、无水乙酸钠4g、牛肉浸膏粉8g、乙酸钾4g、无水氯化钙2.4g、硫酸镁0.4g、硫酸锰0.1g、L-半胱氨酸盐酸盐0.6g、0.8mL吐温-80和蒸馏水1000mL。3.根据权利要求1所述的一种提高保加利亚乳杆菌耐冻性的培养基，其特征在于：所述的培养基配方包括以下组分：甘露糖30g、海藻糖10g、酪蛋白胨6g、无水乙酸钠6g、牛肉浸膏粉10g、乙酸钾5g、无水氯化钙3g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.1g、L-半胱氨酸盐酸盐0.6g、1mL吐温-8...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄少磊，刘彦民，夏少明，李林泉，刘云辉，李晓军，李康宁，郭跃东，马跃英，邢会霞，王潇，焦志军，王春颖，冯谦，龚虹，程超，马晓红，王海霞，杨飞雁，田鑫，张春霞，韩至，赵晓燕，
申请(专利权)人：内蒙古双奇药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15