一种猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的保藏方法及其专用保护剂技术

本发明专利技术属于动物疫苗辅助制剂制备技术领域，涉及一种猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的保藏方法及专用保护剂。筛选得到一种在液氮条件下保藏猪霍乱沙门氏疫苗菌株的方法，其特征在于，在猪霍乱沙门氏疫苗菌的保藏期间向所述的猪霍乱沙门氏疫苗菌菌液中加入按质量比计的保护剂，该保护剂的组分按质量比计为蔗糖2.5％，葡聚糖7％，二甲基乙酰胺6％和蛋氨酸0.025％。所述的专用保护剂组成包括如下组分：按质量比计，蔗糖2.5％、葡聚糖7％、二甲基乙酰胺6％和蛋氨酸0.025％。该专用保护剂具有渗透性、半渗透性、非渗透性和抗氧化性的效果，在所筛选出的保护剂配方下不同浓度疫苗菌不同保存时间的存活率无显著差异，存活率均保持在70％以上。

Preservation method and special protective agent for Salmonella cholerae vaccine strain

The invention belongs to the technical field of the preparation of an animal vaccine adjuvant preparation, and relates to a method for preserving a Salmonella cholerae vaccine strain and a special protective agent. A method of preserving the swine cholera Salmonella vaccine under the liquid nitrogen condition was obtained. It was characterized by adding a mass ratio protective agent to the porcine cholera Salmonella vaccine during the preservation of the pig cholera Salmonella vaccine. The component of the protectant was 2.5% sucrose and 7% glucan. Dimethyl amines 6% and methionine 0.025%. The special protective agent comprises the following components: sucrose 2.5%, dextran 7%, dimethyl acetamide 6% and methionine 0.025% according to mass ratio. This special protective agent has the effect of permeability, semi permeability, non permeability and antioxidation. There is no significant difference in the survival rate of different preservation time of different concentration of vaccine bacteria under the selected protectant formula, and the survival rate is above 70%.

【技术实现步骤摘要】
一种猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的保藏方法及其专用保护剂
本专利技术属于疫苗产品辅助制剂的制备
，具体涉及一种猪霍乱沙门氏菌疫苗菌的保藏方法及其专用保护剂。
技术介绍
本专利技术的前期工作是制备了一种名为C500/pGS/2SS疫苗菌(专利申请号：2008101979818，菌株保藏号：CCTCCNO:M208194)，该菌是一种缺失asd基因和crp基因的减毒沙门氏菌，其包含非抗性筛选乙肝表面抗原S基因与双拷贝生长抑素(SS)基因质粒，主要功能是促进动物生长，对于缩短育肥猪的出栏时间、提高饲料利用率以及降低生产成本具有重要意义。本专利技术的前期研究表明C500/pGS/2SS疫苗株在小鼠、牛、猪等动物上取得了良好的免疫效果，同时具有良好的安全性(梁爱心2009；石昭意2015；张剑2010)。目前该疫苗现已进入农业转基因生物安全的生产性试验阶段，但如何长期高效稳定地保藏该疫苗菌株是当前兽医疫苗领域亟待解决的技术问题。在本申请提出以前，申请人对疫苗菌C500/pGS/2SS的保藏方法进行了初步探讨，认为采用冷冻干燥保存法是比较适宜疫苗菌的保藏(李冲，2014)，但该方法保藏的疫苗菌菌株存活率比较低。而且利用冷冻干燥保藏法还存在诸如设备要求高、生产周期长和成本高等缺点，难以进行规模化生产。有关资料显示，-130℃是微生物变异终点，在该温度以下，微生物处于代谢停滞状态，可以长期保存微生物，液氮超低温冷冻保存菌种就是利用该原理。与冻干保存法相比，液氮超低温冷冻保存菌种过程中的损伤主要是冻融损伤，而冻干过程中除冻融损伤外，还存在干燥损伤，因此，采用液氮超低温冷冻保存法常常会取得更好的保藏效果。但目前关于液氮超低温冷冻保存沙门氏菌的研究还未见报道。前人的研究表明，在液氮超低温冷冻的过程中需要注意保持适宜的降温速率，若降温速率太快，则细胞内水分来不及流出细胞，形成大量的细胞内冰晶，加大了对细胞膜和胞内功能蛋白的机械损伤(Gwoetal2005)。而降温速率太慢又会导致细胞的过度脱水，胞内溶质浓度升高，增大溶质损伤(Fieldsetal1997)。目前本领域针对不同的降温速率，常用的液氮超低温冷冻保藏方法主要为三种，一是一步冷冻法(即直接将疫苗菌投入液氮罐中保藏)；二是两步冷冻法(即，先将疫苗菌在-80℃冷冻，然后置于液氮罐中)；三是三步冷冻法(即，疫苗菌先在-20℃下冻藏，然后在-80℃保藏，最后转入液氮罐中保藏)，研究表明，两步冷冻法是较一步冷冻法和三步冷冻法更优化的保藏方法(Santiago-Vázquezetal2007)。保护剂按作用类型不同，可分为渗透性保护剂、半渗透性保护剂、非渗透性保护剂和抗氧化剂等。渗透性保护剂既可以透过细胞壁也可以透过细胞膜，防止细胞内大冰晶的形成以及细胞过度脱水所造成的溶质损伤；而半渗透性保护剂能通过细胞壁而不能通过细胞膜，可使细胞在冷冻前先部分脱水，保护剂在细胞壁和细胞膜之间浓缩，形成缓冲层，从而机械性的保护细胞；非渗透性保护剂既不能通过细胞壁也不能通过细胞膜，其保护作用主要体现在细胞外；而抗氧化剂主要作用是防止菌种储存过程中的氧化变质。由于不同类型保护剂的保护作用不同，因此一般不单独使用，通常是多种类型保护剂复配后才能对菌种起到最大程度的保护。
技术实现思路
本专利技术的任务在于克服现有猪霍乱沙门氏菌疫苗菌保藏方法和保护剂存在的的缺陷，研制一种适合猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株保藏方法及其专用保护剂，以达到长期保藏猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株，提高猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的存活率，实现规模化生产的目的。在本专利技术中申请人以疫苗菌(例如沙门氏菌C500/pGS/2SS)的存活率为攻关指标，针对不同浓度下几种常见的渗透性、半渗透性、非渗透性保护剂(或称抗氧化剂)的保护效果进行了筛选，在四种保护剂的最适浓度周围设置三个水平，通过正交设计筛选出了最佳保护剂配方为：按配方的质量比计，蔗糖2.5％、葡聚糖7％、二甲基乙酰胺6％和蛋氨酸0.025％。利用所述的上述最佳保护剂对不同浓度下猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株的存活率均在70％以上。本专利技术的具体步骤如下所述：(1)将不同浓度的保护剂与浓度为109CFU/ml猪霍乱沙门氏菌菌液等以体积混合，置于冻存管中，于-80℃下放置12h后迅速投入-196℃的液氮罐中，保存7天后将菌液取出，置于37℃水浴锅中30min，采用细菌平板计数法对菌种的存活率进行检测，筛选出保藏效果最好的保护剂和保存效果最佳时的保护剂浓度。(2)采用步骤(1)的冷冻方法，在步骤(1)筛选出的四种保护剂最适浓度附近再设置3个浓度水平的保护剂试验，通过L934正交试验、极差分析和方差分析，筛选出了与该冷冻保藏法相匹配的专用保护剂。(3)利用步骤(2)筛选出的专用保护剂，检测了不同浓度保藏的猪霍乱沙门氏菌菌株在-196℃液氮超低温冷冻保藏一周、四周后的保存率，评价保护剂的保护效果和储存稳定性。本专利技术的有益成果如下：(1)本专利技术获得了一种保存猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株液氮超低温冷冻保存法，与常用的冻干保存法相比，本专利技术对保藏设备要求更低、操作更简便，有利于基层单位推广应用。(2)本专利技术获得了一种与液氮超低温冷冻保存法相适应的专用保护剂。与常用冻干保存法相比，本专利技术的保护剂对液氮超低温冷冻下保藏猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株的存活率更高，储存稳定性更好。附图说明图1：不同保护剂最佳保存浓度下疫苗菌存活率的比较。附图标记说明：图1中的A图显示不同渗透性保护剂最佳保存浓度下疫苗菌存活率的比较；图1中的B图显示不同半渗透性保护剂最佳保存浓度下疫苗菌存活率的比较；图1中的C图显示不同非渗透性保护剂最佳保存浓度下疫苗菌存活率的比较。图2：液氮超低温冷冻保存后pVGS/2SS-asd质粒双酶切电泳图。附图标记说明：泳道1：DNAMaker；泳道2-3：质粒pVGS/2SS-asd经EcoRI和HindIII双酶切。图3：不同浓度猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株在氮冷冻保存4周后存活率的比较。具体实施方式实施例1：液氮超低温冷冻条件下疫苗菌保护剂的筛选1.1菌液的发酵与浓缩取酶切鉴定正确的猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株的菌液(猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株为C500/pGS/2SS)按照体积比为1:100的比例接种于5ml，LB液体LB培养基中，置于37℃气浴恒温摇床200r/min振荡培养14h，随后将振荡培养的菌液按照体积比为1:100的比例接种于350ml，LB液体LB培养基中，于37℃，200r/min振荡培养15h，4000r/min离心10min，弃去上清液，用无菌磷酸盐缓冲液(简称PBS，即磷酸盐缓冲液，pH7.2，浓度0.01M：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)2.90g，磷酸二氢钾0.20g，氯化钠8.00g，氯化钾0.20g，加水充分溶解后定容至1L，在121℃高温高压蒸汽下灭菌30min备用)溶解，调节菌液浓度至109CFU/ml。1.2液氮超低温冷冻保存猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株C500/pGS/2SS保护剂的筛选将调整后的猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株菌液与以下各保护剂按照1:1(体积比)的比例等体积混合分装于冻存管中，使菌悬液中各保护剂的终浓度如表1所示。表1本专利技术的专用保护剂及其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在液氮条件下保藏猪霍乱沙门氏疫苗菌株的方法，其特征在于，在猪霍乱沙门氏疫苗菌的保藏期间向所述的猪霍乱沙门氏疫苗菌菌液中按体积比1：1加入保护剂，该保护剂的组分按质量比计为蔗糖2.5％，葡聚糖7％，二甲基乙酰胺6％和蛋氨酸0.025％。

【技术特征摘要】
1.一种在液氮条件下保藏猪霍乱沙门氏疫苗菌株的方法，其特征在于，在猪霍乱沙门氏疫苗菌的保藏期间向所述的猪霍乱沙门氏疫苗菌菌液中按体积比1：1加入保护剂，该保护剂的组分按质量比计为蔗糖2.5％，葡聚糖7％，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨利国，梁爱心，于垚垚，刘文浩，牛凯峰，王力军，刘爽，王亚平，姜婷婷，乔同，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42