一种蓝猪耳遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种蓝猪耳遗传转化方法，该方法涉及遗传工程技术领域，具有操作简单，能快速有效的获得转基因植株的特点。该方法在传统的农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化中，加入了表面活性剂——Silwet L‑77，降低了叶片表面张力，使农杆菌充分接触叶片伤口，获得了较高的遗传转化效率。由于传统的遗传转化多采用叶盘诱导丛生芽来获得转基因株系，获得的抗性苗阳性率低，本方法利用愈伤诱导丛生芽的方法获得转基因苗，大大增加了阳性率。本方法对传统的遗传转化过程进行了优化，缩短了转化周期，获得了可稳定遗传的转基因植株，这个优良的转化系统为应用基因工程手段研究被子植物双受精的细胞与分子机制奠定基础。

A genetic transformation method of blue pig ear

The invention discloses a genetic transformation method of blue pig ear, which relates to the technical field of genetic engineering and has the characteristics of simple operation and rapid and effective acquisition of transgenic plants. In the traditional Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of blue pig ear, the surface active agent, Silwet L 77, has been added to reduce the surface tension of the leaves, make the Agrobacterium tumefaciens fully exposed to the wound of the leaves, and obtain a high efficiency of genetic transformation. Due to the traditional genetic transformation, the transgenic lines were obtained by inducing tufted buds with leaf discs, and the positive rate of resistant seedlings was low. This method used the method of callus induction to induce the cluster buds to obtain transgenic seedlings, which greatly increased the positive rate. This method optimizes the traditional genetic transformation process, shortens the transformation cycle and obtains a stable genetic transgenic plant. This excellent transformation system lays the foundation for the study of the cell and molecular mechanism of the double fertilization of angiosperms by means of genetic engineering.

【技术实现步骤摘要】
一种蓝猪耳遗传转化方法
本专利技术涉及转基因及组织培养
，特别涉及一种蓝猪耳遗传转化方法。
技术介绍
蓝猪耳(Toreniafournieri)又名夏堇，属双子叶植物门，合瓣花亚纲，玄参科蓝猪耳属。被子植物的胚囊大多数都是紧密包裹在胚珠珠心组织里，生殖过程的受精机理及代谢活动需借助经典结构植物学研究技术如半薄、超薄切片及组织透明法等[YouRLetal.,1985；JensenWAetal.,1965；Malamyetal.,1997]，才能做进一步研究。若动态的观察被子植物受精过程中卵细胞的变化状态，蓝猪耳更为适合。蓝猪耳雌配子成熟的过程中，胚囊会从珠孔端伸出珠被组织之外。待卵器完全成熟，在光学显微镜下清晰可见。这种特殊的半裸露胚囊结构，为研究被子植物生殖生物学和发育生物学提供了很好的研究材料，对高等植物双受精机理和早期胚胎发育的研究具有重要的意义。完整的植物组织培养系统与根癌农杆菌介导的遗传转化系统组成了转基因植物构建的一般系统。蓝猪耳茎段和叶片在不同浓度的生长激素相配合的作用下可以诱导出根、芽和愈伤组织等植物器官：1/2MS、6-BA、NAA相结合可以诱导不定芽的产生，而MS、6-BA、2,4-D配合可诱导愈伤组织，生根培养基为1/2MS[Chlyahetal.,1973；Kamadaetal.,1979；佟晓楠等，2004；宾金华等，2004；李梅兰等；2005]；同时花芽和胚也可以作为蓝猪耳组织培养的外植体诱导出植物组织[Tanimotoetal.,1981；Tanimotoetal.,1985]。Aida在1996年就对蓝猪耳分子育种进行了相关研究，初步建立了农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化系统。Fukusaki成功诱导出白色和浅色花瓣的转基因株系[Fukuaaketal.,2005]。在蓝猪耳遗传转化的过程中，常以叶片作为外植体，且共培养阶段比较重要，其中菌液浸染植物材料的时间以10～20min为宜，共培养7天转化率达27％以上[ChenBCetal.,2005]。李梅兰认为在共培养阶段暗培养4天效果最佳，且与诱导愈伤再生体系相比，诱芽时间较短，转化效率相同[LiMLetal.,2006]；龙海涛等人利用愈伤诱导系统对蓝猪耳进行遗传转化，该方法转化率达13％～14％[LongHTetal.,2008]。浸染过程是转化过程中重要的步骤，浸染效率直接关系到后期材料的转化率。
技术实现思路
本专利技术在已有研究的基础上对浸染条件及后续流程进行了优化，首次在蓝猪耳转化的过程中加入了SilwetL-77，使农杆菌的浸染效率得到了显著提高；并且添加了头孢清洗步骤来去除农杆菌污染，固体培养基上降低了头孢浓度，减少了对抗性芽生长的抑制。通过定位于卵细胞的特异性启动子DD45(DD45是一种特异性表达于卵细胞的启动子，在单子叶植物水稻与双子叶植物拟南芥体内均可表达)，构建载体DD45：MT-GFP，对蓝猪耳卵细胞线粒体进行特异性标记，结果表明，本专利技术的蓝猪耳遗传转化方法转化率高，且可以稳定遗传。本专利技术的目的是按以下技术方案实现的：一种蓝猪耳遗传转化方法所述方法包括：(1)共培养阶段：将蓝猪耳无菌苗叶片剪成边长小于1cm的小片后，放入到OD600＝0.7的菌液中5min；所述菌液中含有0.01vol％SilwetL-77、20μmol/LAS；然后将叶片转移至共培养培养基中23～25℃避光培养4～7天；共培养阶段所用的固体培养基成分是：MS；6-BA1.0mg/L；2,4-D0.1mg/L；AS200μmol/L；(2)愈伤诱导阶段：将步骤1共培养之后的材料转移至愈伤诱导培养基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培养，培养三周；愈伤诱导培养基基成分是：MS；6-BA1.0mg/L；2,4-D0.1mg/L；Kan200mg/L；Cef300mg/L；(3)芽诱导阶段：将步骤2获得的抗性愈伤组织转移至芽诱导培养基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培养7天，诱导出抗性芽，芽诱导培养基成分是：1/2MS；6-BA1.0mg/L；IAA0.1mg/L；Cef300mg/L；(4)抗性芽筛选阶段：将步骤3培养后的材料转移至筛选抗性芽培养基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培养三周，得到2～3cm高的墨绿色小苗；抗性芽培养基培养基成分是：MS；6-BA1.0mg/L；IAA0.1mg/L；Kan200mg/L；Cef300mg/L。(5)生根阶段培养：将步骤4的墨绿色小苗剪下，扦插至生根培养基，待小苗长至4-6cm即可炼苗，移栽至花盆，生根培养基成分是：1/2MS；IAA0.4mg/L；Kan50mg/L。进一步地，所述蓝猪耳无菌苗叶片来源于3-5周苗龄的外植体的叶片。进一步地，菌液为农杆菌菌液，培养农杆菌的培养基为液体LB培养基。进一步地，其特征在于，所述农杆菌菌株是GV3101。本专利技术具有以下积极效果：1、蓝猪耳是发育生物学模式植物，其半裸露的胚囊极大的降低了对被子生物生殖生物学的研究难度，而此优良的转基因系统的建立，大大的缩短了蓝猪耳的研究难度，为被子植物双受精的研究奠定了基础。2、本专利技术在实验方法中加入了表面活性剂增强了农杆菌的浸染效率，从而蓝猪耳遗传转化率也得到了提高。3、本专利技术加入除菌环节，有效的预防了农杆菌过渡生长带来的材料污染。4、本专利技术首先利用低浓度的抗生素对叶片进行抗性愈伤组织的诱导，随后利用物抗培养基让抗性愈伤组织充分分化，产生不定芽，随后又利用高浓度的抗生素筛选抗性芽，此过程完整进行使农杆菌介导的遗传转化获得了高阳性率的转基因株系。附图说明图1为蓝猪耳遗传转化的过程图。A-B是共培养阶段的材料，C-D是抗性愈伤诱导阶段的材料，E-F是芽诱导阶段的材料，G-H是抗性芽诱导阶段的材料，I是生根阶段的材料，J是阳性苗。图2是转基因蓝猪耳基因组的PCR扩增检测图。其中C+、C-分别是阳性和阴性对照，P1-P10即为所检测得转基因植株。图3ABC均为转基因植株的荧光观察图，其中BC采用绿色荧光标记，其中的荧光点即为蓝猪耳卵细胞的线粒体。具体实施方式为使本邻域技术人员更好地理解，将一些术语解释如下。吲哚乙酸，英文名为indole-3-aceticacid，缩写为IAA。6-苄氨基嘌呤，英文名为6-Benzylaminopurine，缩写为6-BA。2,4-二氯苯氧乙酸，英文名为2,4-dichlorophenoxy，缩写为2,4-D。卡那霉素，英文名为Kanamycin，缩写为Kan。利福平，英文名为Rifampin，缩写为Rif。庆大霉素，英文名为Gentamicin，缩写为Gen。头孢噻肟钠，英文名为CefotaximeSodium，缩写为Cef。乙酰丁香酮，英文名为Acetosyringone，缩写为AS。SilwetL-77，表面活性剂的一种，可降低液体表面张力。MS培养基，英文名为MSculturemedium，缩写名为MS。下面结合附图、实施例对本专利技术作进一步描述：生长素及其他抗生素的配制本专利技术用到的生长激素有IAA、6-BA、2，4-D，其中6-BA配制时用少量NaOH(1mol/L)溶解，随后定容至所需体积；2,4-D和IAA需用少量无水乙醇溶剂，随后定容；以上生长激素定容至所需浓度之本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蓝猪耳遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括：(1)共培养阶段：将蓝猪耳无菌苗叶片剪成边长小于1cm的小片后，放入到OD600＝0.7的菌液中5min；所述菌液中含有0.01％(v/v)Silwet L‑77、20μmol/LAS；然后将叶片转移至共培养培养基中23～25℃避光培养4～7天；共培养阶段所用的固体培养基成分是：MS；6‑BA 1.0mg/L；2,4‑D 0.1mg/L；AS 200μmol/L；(2)愈伤诱导阶段：将步骤1共培养之后的材料转移至愈伤诱导培养基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培养，培养三周；愈伤诱导培养基基成分是：MS；6‑BA1.0mg/L；2,4‑D0.1mg/L；Kan200mg/L；Cef 300mg/L；(3)芽诱导阶段：将步骤2获得的抗性愈伤组织转移至芽诱导培养基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培养7天，诱导出抗性芽，芽诱导培养基成分是：1/2MS；6‑BA1.0mg/L；IAA 0.1mg/L；Cef 300mg/L；(4)抗性芽筛选阶段：将步骤3培养后的材料转移至筛选抗性芽培养基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培养三周，得到2～3cm高的墨绿色小苗；抗性芽培养基培养基成分是：MS；6‑BA1.0mg/L；IAA 0.1mg/L；Kan 200mg/L；Cef 300mg/L。(5)生根阶段培养：将步骤4的墨绿色小苗剪下，扦插至生根培养基，待小苗长至4～6cm即可炼苗，移栽至花盆，生根培养基成分是：1/2MS；IAA0.4mg/L；Kan 50mg/L。...

【技术特征摘要】
1.一种蓝猪耳遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括：(1)共培养阶段：将蓝猪耳无菌苗叶片剪成边长小于1cm的小片后，放入到OD600＝0.7的菌液中5min；所述菌液中含有0.01％(v/v)SilwetL-77、20μmol/LAS；然后将叶片转移至共培养培养基中23～25℃避光培养4～7天；共培养阶段所用的固体培养基成分是：MS；6-BA1.0mg/L；2,4-D0.1mg/L；AS200μmol/L；(2)愈伤诱导阶段：将步骤1共培养之后的材料转移至愈伤诱导培养基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培养，培养三周；愈伤诱导培养基基成分是：MS；6-BA1.0mg/L；2,4-D0.1mg/L；Kan200mg/L；Cef300mg/L；(3)芽诱导阶段：将步骤2获得的抗性愈伤组织转移至芽诱导培养基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培养7天，诱导出抗性芽，芽诱导培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丹阳，高龙，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61