从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞的方法。一方面，本发明专利技术涉及分离和培养脂肪间充质干细胞的方法，步骤为：将通过抽脂获取掺杂有膨胀液的脂肪样本于离心管中，离心；移除最上层油脂，并分别移取悬浮的脂肪颗粒和底层细胞沉淀，备用；向所得脂肪颗粒中加入消化酶混合液，振荡消化，终止消化，重悬细胞沉淀；底层细胞沉淀加红细胞裂解液静置裂解，离心，重悬细胞沉淀；合并细胞悬液，分离出作为原代的脂肪间充质干细胞；进一步将其进行培养繁殖。还涉及由此方法制得的脂肪间充质干细胞制剂，用于分离脂肪间充质干细胞的消化酶混合液，以及用于培养脂肪间充质干细胞的培养基。本发明专利技术各方面呈现如说明书所述的优异技术效果。

Method for obtaining large amount of adipose derived mesenchymal stem cells from fat

The present invention relates to a method for obtaining a large number of adipose derived mesenchymal stem cells from fat. On the one hand, the present invention relates to a method for separating and cultivating adipose mesenchymal stem cells. The steps are as follows: the fat samples which are doped with expansive liquid are obtained in the centrifuge tube by liposuction and centrifuged; the most upper layer of fat is removed, and the suspended fat particles and the underlying cells are removed and deposited separately, and the fat particles are added to the obtained fat particles. Enzyme mixed solution, digestion, digestion, suspension of cell precipitation, the underlying cells precipitated with red cell lysate, centrifuged, suspended cells and precipitated, combined with cell suspension, separated as primary mesenchymal stem cells, and further cultured and propagated. It also involves the adipose mesenchymal stem cells prepared by this method, the digestive enzyme mixture used to separate adipose mesenchymal stem cells, and the culture medium for the cultivation of adipose mesenchymal stem cells. All aspects of the invention present excellent technical results as described in the instruction.

【技术实现步骤摘要】
从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种脂肪间充质干细胞的获取方法，特别是涉及一种自体脂肪间充质干细胞的培养方法。本专利技术还涉及上述自体脂肪间充质干细胞培养中所用的培养基。使用本专利技术培养基培养所述自体脂肪间充质干细胞时，能够呈现本专利技术所述优异技术效果。得到的这些自体脂肪间充质干细胞可以用于自体应用。
技术介绍
间充质干细胞(MCS)是成人干细胞具有多向分化潜能的热点细胞，是一种大多数成人器官中发现的具有骨形成能力和造血功能的细胞群体，可以从骨髓、脐血、脂肪中提取，在特定的培养条件下，间充质干细胞可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和肌细胞等。间充质干细胞是目前组织工程的主要种子细胞。经历了多年多学者的研究后，虽然组织工程已经获得了很大进展，然而，但由于目前缺乏理想筛选方法，间充质干细胞不易获取、体外扩增困难等限制，使其在临床级别回输的应用受到限制。因此，寻找一种易于获得、免疫原性低、易于体外扩增的临床治疗级别的种子细胞是目前组织工程迫切需要解决的问题之一。人们已经从脂肪组织分离出一类具有多向分化潜能的干细胞，并在体外培养特殊体系中成功地分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞与肌细胞等，这种可分化的干细胞被认可为脂肪来源的间充质细胞，即脂肪干细胞或脂肪间充质干细胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，脂肪干细胞具有分化多胚层全能性特征，其中包括中胚层，内胚层和外胚层分化细胞的能力，能分泌许多潜在的有利的生长因子和细胞活素以细胞为基础的促进创面愈合的治疗方法快速发展。脂肪源性干细胞是一群多功能间充质干细胞，可以分化为其他的细胞系在脂肪组织的非脂肪(间质)碎片中存在大量的脂肪源性细胞，且易于分离获取。作为各种组织缺损的辅助治疗方法，脂肪源性干细胞被推荐应用。在创面愈合过程中，血管再生是一个重要的步骤新生血管的形成是支持肉芽组织形成和角化细胞存活扩增愈合创伤的的必要条件。因此认为，脂肪源性干细胞是通过快速促血管再生从而促进创面的愈合。另外，脂肪源性干细胞还显示出通过细胞分化以及分泌促进胶原合成和真皮成纤维细胞迁移的长因子来促进创面的愈合人们已将脂肪源性干细胞与细胞外基质支架成分联合应用于动物的皮肤软组织创面，发现脂肪源性干细胞以促进支架的血管化能力。有研究结果显示，脂肪源性细胞对创面愈合的促进作用与脂肪源性干细胞促进上皮化和肉芽组织的形成有关，并且脂肪源性干细胞有潜在的表皮细胞分化能力研究结果还提示脂肪源性干细胞的远位分化能力是多功能脂肪干细胞对创面的微环境的一个反应。脂肪源性干细胞对局部血管的重塑包括直接分化为血管内皮细胞和分泌血管生长因子，后两者则有益于血管的再生。即是说，脂肪源性干细胞通过细胞分化和血管再生促进创面的愈合。另外，人们将脂肪源性干细胞与血小板源性生长因子，即一种众所周知的参与正常创面愈合过程的因子，联合用于创面的治疗。研究结果显示二者的联合应用有协同作用，即可能通过提高生长因子的水平而促进了创面的愈合。理论上讲，细胞疗法前景广阔，因为多功能干细胞或祖细胞通过对创面缺失组织的再生和持续提供许多有利因子而促进创面的愈合。尽管如此，关于脂肪源性干细胞对创面愈合的机制的研究仍有待于进一步探索。脂肪源性干细胞对局部血管的重塑包括直接分化为血管内皮细胞和分泌生血管生长因子，后两者则有益于血管的再生。脂肪间充质干细胞的应用前景已通过在各疾病动物模型上的应用得以验证，其用来干预治疗糖尿病、肝脏损伤修复、膀肌重建、2型糖尿病阳疹、心肌梗死、脑梗、认知功能障碍、中风、椎间盘修复、胶质母细胞瘤治疗、骨缺损、创伤后血管新生、风湿性关节炎、唇愕裂、心力衰竭、结肠炎、尿失禁等。有研究者将脂肪间充质干细胞转变为心肌细胞，既重新编程了成熟的干细胞，又能改善心脏病的治疗。也有人将脂肪间充质干细胞与纤维蛋白胶复合后注射到心肌梗塞大鼠的左心室壁上，ADSCs在临床组织工程治疗心肌梗塞上会有很大的前景。脂肪间充质干细胞作为种子细胞放于网状支架中，成功地修复了狗的颅骨损伤，为临床治疗颅骨损伤。还有研究应用心脏病人腹部脂肪的脂肪间充质干细胞注射进他们的心脏以后，减少了心脏的损伤、同时也增加了血流，干细胞注射进心脏以后经过6个月，病人心脏接受带氧血液的能力提高，心脏左心室送出的血液也增加了3.5倍，SPELT显像证明接受脂肪间充质干细胞注射的病人心泵的能力增加了5.7％，核磁扫描也显示患者的平均心肌疤痕面积由原来的31.6％下降到15.4％，这一研究成果发布在2010年美国心脏协会科学年会上。脂肪间充质干细胞在组织修复过程中可以调节周围组织中的生长激素和细胞因子等防治细胞凋亡，有试验证明脂肪间充质干细胞可以分泌各种皮肤生长因子如纤维细胞生长因子(Basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)等来促进成纤维细胞繁殖，并具有抗光老化、抗氧化、抗皱、抗紫外辐射等作用。有研究用脂肪间充质干细胞来治疗病人复杂性肛屡已经进入到II期临床实验。还有用人的脂肪间充质干细胞移植入名乳房萎缩、大小不一或需要隆胸的患者乳房中，左右乳房大小均衡对称，乳房X光检测，被修复的乳房自然柔软完全无钙化，无囊肿现象，无明显的注射疤痕。最近的临床研究显示，肌内注射脂肪间充质干细胞对糖尿病足和闭塞性动脉硬化症也有一定的疗效。在注射脂肪间充质干细胞的6个月后，从临床上看，患者的静息疼痛得到了缓解，无痛行走的距离明显延长，而且并未发现任何并发症。有试验显示脂肪间充质干细胞诱导成胰岛样细胞回输糖尿病患者，术后随访23个月，发现患者的外源性胰岛素用量下降，患者的平均体重增加了而且患者无不适或副反应。有学者研究发现脂肪组织参与创伤修复，当脂肪细胞受到创伤刺激后，基因表达发生应激性分泌TNF-a、IL-1、IL-6、细胞间粘附因子、趋化因子，急性反映蛋白，受体等炎症基质的基因表达都会增加，这些因子调控都是我们了解脂肪细胞参与修复的内在治疗机制，这种调节体系是值得我们思考的精密调控。获得的科研成果是丰富创伤修复的理论基础。临床应用伤及真皮下组织脂肪层的深度皮损创伤，脂肪回输治疗均可以达到加速创面修复的理想治疗效果，国外研究学者也应用脂肪细胞，胶原蛋白与弹性蛋白应用组织工程技术制备含有脂肪细胞的人工皮肤，临床应用发现可减少全层皮肤缺损的组织修复造成的创面收缩，这一现象提示我们脂肪组织中存在具有修复作用的因子与细胞。脂肪间充质干细胞对细胞外基质的黏附强快速特性，体外筛选培养的人脂肪来源的间充质干细胞得以在国内外方法特异性发展。而干细胞生物学性能，可以做到增进功能、避免潜在有害基因及对干细胞控制分化时间与控制不同分化方向等，在基础科研、临床治疗、干细胞治疗研究方向、皮肤再生损伤修复、高拟组织工程皮肤的构建方面等均有历史时期不可取代的指导意义。获得脂肪来源的间充质干细胞还可以应用临床相关疾病细胞治疗的回输治疗，以及美容整形注射用填充。脂肪间充质干细胞(ADSCs)作为来源于脂肪的间充质干细胞，取材方便，其提取效率比骨髓间充质干细胞高40倍，并且体外培养条件下增殖速度更快；具有多向分化能力，可以向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞，甚至神经细本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离和培养脂肪间充质干细胞的方法，其包括如下步骤：(1)将通过抽脂获取掺杂有膨胀液的脂肪样本于离心管中，500～1000rpm离心2～5min；(2)移除最上层油脂，并分别移取悬浮的脂肪颗粒和底层细胞沉淀，备用；(31)向步骤(2)所得脂肪颗粒中以体积比1：0.8～1.2加入消化酶混合液，在37℃以100rpm振荡消化20～40min；消化结束后，加入等体积的完全培养基终止消化，1000～2000rpm离心3～8min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；(32)将步骤(2)所得底层细胞沉淀用PBS重悬，加入等量红细胞裂解液静置5～15min进行裂解；红细胞充分裂解后，1000～2000rpm离心3～8min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；(4)合并步骤(31)和(32)所得细胞悬液，100μm滤网过滤，分离出作为原代的脂肪间充质干细胞；(5)将分离出的原代脂肪间充质干细胞按照30000细胞/cm^2接种至培养瓶进行培养，加入完全培养基，37℃5％CO2培养；(6)培养2天后换液，去除非贴壁细胞，待生长到一周时，收获P1代脂肪间充质干细胞；(7)取少量细胞照步骤(5)和步骤(6)继续传代至下一代直至P5代，收获并观察各代次脂肪间充质干细胞，并进行相关检测。...

【技术特征摘要】
1.分离和培养脂肪间充质干细胞的方法，其包括如下步骤：(1)将通过抽脂获取掺杂有膨胀液的脂肪样本于离心管中，500～1000rpm离心2～5min；(2)移除最上层油脂，并分别移取悬浮的脂肪颗粒和底层细胞沉淀，备用；(31)向步骤(2)所得脂肪颗粒中以体积比1：0.8～1.2加入消化酶混合液，在37℃以100rpm振荡消化20～40min；消化结束后，加入等体积的完全培养基终止消化，1000～2000rpm离心3～8min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；(32)将步骤(2)所得底层细胞沉淀用PBS重悬，加入等量红细胞裂解液静置5～15min进行裂解；红细胞充分裂解后，1000～2000rpm离心3～8min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；(4)合并步骤(31)和(32)所得细胞悬液，100μm滤网过滤，分离出作为原代的脂肪间充质干细胞；(5)将分离出的原代脂肪间充质干细胞按照30000细胞/cm^2接种至培养瓶进行培养，加入完全培养基，37℃5％CO2培养；(6)培养2天后换液，去除非贴壁细胞，待生长到一周时，收获P1代脂肪间充质干细胞；(7)取少量细胞照步骤(5)和步骤(6)继续传代至下一代直至P5代，收获并观察各代次脂肪间充质干细胞，并进行相关检测。2.根据权利要求1的方法，其特征在于：步骤(1)中，以800rpm离心3min；步骤(31)中，脂肪颗粒与混合酶以体积比1：1的比例加入；步骤(31)中，在37℃以100rpm振荡消化3min；步骤(31)中，终止消化后，以1500rpm离心5min；步骤(32)中，加入等量红细胞裂解液静置10min进行裂解；步骤(32)中，红细胞充分裂解后，1500rpm离心5min；其中还包括使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行制剂的制备步骤；和/或其中还包括使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行细胞冻存的步骤，任选的对所冻存的细胞进行复苏，以及任选的对复苏的细胞进行制剂的制备。3.根据权利要求1的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述膨胀液包含：0.1mg/ml利多卡因和0.02ug/ml肾上腺素；所述消化酶混合液中包含：0.05％胶原酶I型、0.05％胶原酶II型、0.03％中性蛋白酶、0.03％DNA酶，以及任选的异丙醇；和/或所述完全培养基包含：低糖型DMEM、10％FBS、25mM的HEPES、1μg/ml的EGF、2μg/ml的bFGF、0.02μg/ml的TGF-β、0.05μg/ml的IGF和任选的山梨醇。4.根据权利要求1的方法，其特征在于：所述DMEM为低糖型DMEM；所述低糖型DMEM配方组成如下：无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL；所述完全培养基组成为：100mL的FBS、25mM的HEPES、1μg/ml的EGF、2μg/ml的bFGF、0.02μg/ml的TGF-β、0.05μg/ml的IGF、0.05％山梨醇、无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL；所述脂肪是从人体任何部位获取的脂肪；所述细胞冻存使用的冻存液组成为：1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基；和/或步骤(7)中，所述相关检测是指检测细胞形态以及免疫表型鉴定；例如，所述免疫表型鉴定是指对CD73、CD90、CD105和CD19、CD11b、CD31、CD45、HLADR、CD34进行检测。5.一种脂肪间充质干细胞制剂，其是通过包括如下步骤的方法制备得到的：(1)将通过抽脂获取掺杂有膨胀液的脂肪样本于离心管中，500～1000rpm离心2～5min；(2)移除最上层油脂，并分别移取悬浮的脂肪颗粒和底层细胞沉淀，备用；(31)向步骤(2)所得脂肪颗粒中以体积比1：0.8～1.2加入消化酶混合液，在37℃以100rpm振荡消化20～40min；消化结束后，加入等体积的完全培养基终止消化，1000～2000rpm离心3～8min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；(32)将步骤(2)所得底层细胞沉淀用PBS重...

【专利技术属性】
技术研发人员：王芳，梅俊，
申请(专利权)人：英科博雅生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32