一种用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液制造技术

本发明专利技术公开了一种用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液，是以不含L‑谷氨酰胺的高糖DMEM‑F12培养基为基液，添加L‑丙氨酰‑L谷氨酰胺、维生素C、HEPES、类胰岛素生长因子、表皮生长因子、脂质浓缩物、人血白蛋白、转铁蛋白、海藻糖、肝素钠和Pluronic F‑68制成。本发明专利技术公开的培养液不含任何血清成分，成分明确、批次稳定、质量可控、成本低廉，不仅适用于实验室常规培养，也适用于大规模生产培养，应用前景广泛。

A culture medium for serum-free suspension culture of 293T cells

The invention discloses a culture medium for serum-free suspension culture of 293T cells, which is based on a high sugar DMEM F12 medium without L glutamine, adding L malpropane L glutamine, vitamin C, HEPES, insulin like growth factor, epidermal growth factor, fat concentrate, Human Albumin and transferrin. It is made from trehalose, heparin sodium and Pluronic F F 68. The culture medium of the invention has no serum components, with clear composition, stable batch, controllable quality and low cost. It is not only suitable for routine laboratory cultivation, but also suitable for large-scale production and cultivation, and has a wide application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液。
技术介绍
293T细胞是由293细胞派生并表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系，是包装病毒的主要细胞。随着细胞治疗和基因治疗技术的快速发展，尤其在CAR-T疗法药物成功上市以来，293T无血清悬浮培养的产业化和规模化更为迫切。尽管ATCC将293T细胞进行了商业化处理后得到比较稳定的细胞系，但在实际生产过程中，由于293T细胞的用量较大且传代次数过多，细胞的生物学特性就会发生改变，影响病毒的包装效率。目前293T细胞的常规培养方法多采用贴壁并添加血清进行培养，贴壁培养导致培养效率低，空间利用率低，仪器、耗材、人工等成本的增加；而血清成分复杂，批次间差异较大，血清质量的检定较为复杂，用此细胞生产的病毒质量难以控制，并且增加产品的检测项目，耗费大量的人力物力。而目前市售的悬浮无血清培养基，多存在悬浮驯化效率低、细胞增殖慢、细胞特性不稳定、价格昂贵等问题。针对这一问题，迫切需要结合中国2015版《中国药典》和《药品生产质量管理规范》等政策要求，设计一套无血清悬浮培养293T细胞培养液，以提高细胞增殖效率、保持细胞特性、增强病毒包装效率、降低商品成本及价格。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液。本专利技术所述用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液，该培养液不含血清成分，是以市售DMEM-F12培养基为基液添加L-丙氨酰-L谷氨酰胺、维生素C、HEPES、类胰岛素生长因子(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)、脂质浓缩物、人血白蛋白、转铁蛋白、海藻糖、肝素钠、PluronicF-68制成；其特征在于：所述培养液中的DMEM-F12培养基为不含L-谷氨酰胺的高糖DMEM-F12培养基，其中含有500～1500mg/LL-丙氨酰-L谷氨酰胺、0.1～1mg/L维生素C、2383～11915mg/LHEPES、5～200μg/L类胰岛素生长因子(IGF-1)、10～100μg/L表皮生长因子(EGF)、1～5ml/L脂质浓缩物、1～2g/L人血白蛋白、0.1～1mg/L转铁蛋白、1～4mg/L海藻糖、1250～12500U/L肝素钠和1～20ml/LPluronicF-68(10％，100×)。上述的用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液中：所述培养液中优选含有700～1100mg/LL-丙氨酰-L谷氨酰胺、0.2～0.6mg/L维生素C、4000～6500mg/LHEPES、10～28μg/L类胰岛素生长因子(IGF-1)、40～60μg/L表皮生长因子(EGF)、2～3ml/L脂质浓缩物、1.5～2g/L人血白蛋白、0.3～0.7mg/L转铁蛋白、2～3mg/L海藻糖、10000～12500U/L肝素钠和5～15ml/LPluronicF-68(10％，100×)。上述的用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液中：所述培养液中最优选含有862mg/LL-丙氨酰-L谷氨酰胺、0.4mg/L维生素C、5958mg/LHEPES、20μg/L类胰岛素生长因子(IGF-1)、50μg/L表皮生长因子(EGF)、2ml/L脂质浓缩物、2g/L人血白蛋白、0.5mg/L转铁蛋白、2mg/L海藻糖、12500U/L肝素钠和1～20ml/LPluronicF-68(10％，100×)。上述用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液中所涉及的原料均为市售产品，其中类胰岛素生长因子包括重组人胰岛素样生长因子，人血白蛋白包括重组人血白蛋白，脂质浓缩物特指ThermoFisher供应的货号为11905031的产品，规格为100ml/瓶。上述用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液的制备：1.使用电子天平精确称量500～1500mgL-丙氨酰-L谷氨酰胺、0.1～1mg维生素C和2383～11915mgHEPES，将称量好的成分倒入烧杯中，加入500ml不含L-谷氨酰胺的高糖DMEM-F12培养液为基液进行溶解。2.待步骤1中所述固体组分完全溶解后，再依次加入0.25～10mlIGF-1溶液，0.2～2mlEGF溶液，1～5ml脂质浓缩物，5～10ml人血白蛋白，0.01～0.1ml转铁蛋白，0.1～0.4ml海藻糖，0.2～2ml肝素钠，1～20mlPluronicF-68，充分混匀。3.将步骤2中配制的混合液转入1L容量瓶中，再补加不含L-谷氨酰胺的高糖DMEM-F12培养液定容至1L，并使用NaHCO3调节混合液pH值至7～7.2，无菌环境下进行0.22μm过滤除菌，得到无血清悬浮培养293T细胞的培养液，4℃储存备用。4.此时得到的无血清悬浮培养293T细胞的培养液中各成分终浓度为L-丙氨酰-L谷氨酰胺500～1500mg/L、维生素C0.1～1mg/L、HEPES2383～11915mg/L、IGF-15～200μg/L、EGF10～100μg/L、脂质浓缩物1～5ml/L、人血白蛋白1～2g/L、转铁蛋白0.1～1mg/L、海藻糖1～4mg/L、肝素钠1250～12500U/L、PluronicF-68(10％，100×)1～20ml/L。上述制备过程均在20～30℃的无菌车间中进行，保证产品无菌。上述无血清悬浮培养293T细胞的培养液可用于293T细胞的无血清悬浮驯化培养和传代培养。其中所述培养液将常用的L谷氨酰胺改为L-丙氨酰-L谷氨酰胺，以减少细胞大规模培养过程中毒性氨的浓度，增加氨基酸的利用；该培养液还含有类胰岛素生长因子、转铁蛋白、人血清白蛋白、脂质浓缩物、海藻糖、肝纳素、PluronicF-68和表皮生长因子(EGF)，可作为血清替代物为细胞提供必需的营养物质，肝纳素的添加可缓解细胞培养过程中的结团现象，以增加细胞的培养效率。本专利技术公开的无血清悬浮培养293T细胞的培养液，各成分稳定，来源明确，培养的细胞批次间稳定，质量可控。使用该细胞培养液培养的细胞增殖快，细胞活性保持周期长，长期培养细胞不结团，冻存效率高，成本低廉；并与传统293T细胞贴壁培养基的相比，该配方培养的悬浮细胞在转染HIV慢病毒时转染效率更高。本专利技术所述的无血清悬浮培养293T细胞的培养液适用于规模化生产，能为生物医疗行业提供质美价廉的293T细胞无血清悬浮培养液。附图说明图1为本专利技术的无血清悬浮培养293T细胞的培养液培养与市售无血清培养基培养的293T细胞形态比较。其中：A为本专利技术的无血清悬浮培养293T细胞的培养液培养的293T的形态；B为市售的无血清培养基培养的293T的形态。图2为本专利技术的无血清悬浮培养293T细胞的培养液培养与市售无血清培养基培养的293T细胞包装HIV慢病毒的效率对比。其中：A为本专利技术的无血清悬浮培养293T细胞的培养液培养的293T细胞的包装效率；B为市售的无血清培养基培养的293T细胞的包装效率。具体实施方式说明：本专利技术中所涉及的原料均为市售产品，其中类胰岛素生长因子包括重组人胰岛素样生长因子，人血白蛋白包括重组人血白蛋白，脂质浓缩物特指ThermoFisher供应的货号为11905031的产品，规格为100ml/瓶。实施例1：最本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液，所述培养液不含血清成分，是以市售DMEM‑F12培养基为基液添加L‑丙氨酰‑L谷氨酰胺、维生素C、HEPES、类胰岛素生长因子(IGF‑1)、表皮生长因子(EGF)、脂质浓缩物、人血白蛋白、转铁蛋白、海藻糖、肝素钠、Pluronic F‑68制成；其特征在于：所述培养液中的DMEM‑F12培养基为不含L‑谷氨酰胺的高糖DMEM‑F12培养基，其中含有500～1500mg/L L‑丙氨酰‑L谷氨酰胺、0.1～1mg/L维生素C、2383～11915mg/L HEPES、5～200μg/L类胰岛素生长因子(IGF‑1)、10～100μg/L表皮生长因子(EGF)、1～5ml/L脂质浓缩物、1～2g/L人血白蛋白、0.1～1mg/L转铁蛋白、1～4mg/L海藻糖、1250～12500U/L肝素钠和1～20ml/L Pluronic F‑68。

【技术特征摘要】
1.一种用于无血清悬浮培养293T细胞的培养液，所述培养液不含血清成分，是以市售DMEM-F12培养基为基液添加L-丙氨酰-L谷氨酰胺、维生素C、HEPES、类胰岛素生长因子(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)、脂质浓缩物、人血白蛋白、转铁蛋白、海藻糖、肝素钠、PluronicF-68制成；其特征在于：所述培养液中的DMEM-F12培养基为不含L-谷氨酰胺的高糖DMEM-F12培养基，其中含有500～1500mg/LL-丙氨酰-L谷氨酰胺、0.1～1mg/L维生素C、2383～11915mg/LHEPES、5～200μg/L类胰岛素生长因子(IGF-1)、10～100μg/L表皮生长因子(EGF)、1～5ml/L脂质浓缩物、1～2g/L人血白蛋白、0.1～1mg/L转铁蛋白、1～4mg/L海藻糖、1250～12500U/L肝素钠和1～20ml/LPluronicF-68。2.根据权利要求1所述的用于无血清悬浮培养293T细胞的培...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋珂慧，陈莉，郭栋，邢晓，张晓朋，罗昀，郭伟，
申请(专利权)人：广东铱科基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44