本发明专利技术属于药物分子模型构建技术领域，具体涉及一种基于ICAM‑1信号通路的高通量药物筛选模型的建立方法。ICAM‑1为重要免疫系统元件，是诸多疾病的重要表征分子。本发明专利技术聚焦ICAM‑1分子及其调控网络，以工程化酵母为媒介构建新型药物筛选系统，在酵母表面展示ICAM‑1高亲和性受体LFA‑1插入结构域并在其胞内表达绿色荧光蛋白。药物如作用于ICAM‑1及其信号途径，将影响酵母细胞与单位动物细胞结合数量，通过荧光强度差异可以快速筛选药物，可用酵母荧光强度指示而达到对ICAM‑1表达量的高效、简便、经济高通量药物筛选。本发明专利技术的可塑性高，可根据不同疾病类型动物细胞建立各自相应药物筛选平台。
Establishment of a high throughput drug screening model based on ICAM-1 signaling pathway
The invention belongs to the technical field of the construction of a drug molecular model, in particular to a method for establishing a high-throughput drug screening model based on the ICAM 1 signaling pathway. ICAM 1 is an important immune system element and an important characterization molecule for many diseases. The present invention focuses on the ICAM 1 molecule and its regulatory network, and constructs a new drug screening system using engineered yeast as a medium to display the ICAM 1 high affinity receptor LFA 1 insertion domain on the yeast surface and express the green fluorescent protein in the cell. Drugs, such as ICAM 1 and its signaling pathway, will affect the number of yeast cells and unit animal cells, and can quickly screen drugs through the difference of fluorescence intensity. It can be used to screen for high throughput, convenient and high throughput drugs for ICAM expression by yeast fluorescence intensity indication. The invention has high plasticity, and can establish respective drug screening platforms according to different disease types of animal cells.
【技术实现步骤摘要】
基于ICAM-1信号通路的高通量药物筛选模型的建立方法
本专利技术属于药物分子模型构建
，具体涉及一种基于ICAM-1信号通路的高通量药物筛选模型的建立方法。
技术介绍
炎症是机体对各种致炎因素及其所产生损伤的防御反应,但过度的炎症反应也会对机体造成损伤(KleimanA和TuckermannJP，2007；CohenJ，2002)。目前临床上常用的抗炎药主要有两类:非甾体抗炎药和甾体类抗炎药。虽然这两类抗炎药都有一定的临床抗炎效果,但长期大量使用也会产生一系列不良反应,如胃粘膜、肝脏、肾脏损害等。天然药物具有来源广、造价低、副作用小等特点,随着对天然药物研究的不断深入,部分天然药物的抗炎作用已经得到认可，寻找低毒高效的新型天然抗炎药物是当前的研究热点之一。酵母表面双杂交系统，是通过分泌途径来分析蛋白互作的一个平台，这种系统是在酵母表面展示系统的基础上发展起来的，优点在于无需蛋白表达纯化，在酵母体内同时表达这两个蛋白并最终展示于酵母表面。在YSD基础上酵母表面展示一个外源蛋白X，另一个蛋白Y则以分泌的形式表达，如果X能结合Y，那么Y则可以与X一起附于酵母表面，利用Y或与Y融合的寡肽的抗体来检测他们的亲和性，并且X和Y之间的亲和性可以通过流式细胞仪定量(Hu,.etal.,2009)。这种技术的创新性在于：①首创Gall和Gall0启动子的联用。②建立利用酵母蛋白分泌途径的蛋白-蛋白相互作用体系。③本系统无需蛋白纯化即可进行蛋白的定向进化以及文库受体筛选。ICAM-1与其受体LFA-1是免疫系统的重要成员。ICAM-1是免疫系统炎症反应的重要分子基础，属于免疫球蛋白超级家族成员之一，蛋白分子量为90kDa，含有5个免疫球蛋白超级家族结构域；ICAM-1通常仅低水平表达于内皮细胞或者其他类型细胞，而细胞因子以及活性氧等激发下通过PKC以及NF-kB等信号途径高水平表达(Long,2011；Rahman和Fazal,2009)。淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocytefunctionassociatedantigen-1,LFA-1)属于整合素家族,整合素是一类重要的细胞黏附分子,是由α和β两个亚基通过非共价键组成的异源二聚体,整合素可以通过其胞内区与胞内的细胞骨架蛋白和信号分子结合,通过由内到外(inside-out)和由外到内(outside-in)双向传递跨膜信号(AbramsP和MarshJW，2010；ZhuJ,2007；ArnaoutM,2005)。LFA-1和ICAM-1可提供协同刺激信号促进淋巴细胞活化、增殖和分化，在T细胞和抗原呈递细胞(antigen-presentingcells,APC)的相互作用中,LFA-1与ICAM-1配接,直接参与启动免疫突触的形成。LFA-1与ICAM-1的相互作用也能介导一系列炎症反应。(LisbyS1989)。白细胞的过度激活是炎症病理过程中的一个重要环节，而白细胞停滞并浸润式的血管外渗依赖于炎症部位白细胞和内皮细胞膜表面黏附因子的表达与功能。ICAM一1作为免疫调节因子,通过受配体LFA-1的相互作用，介导白细胞不同亚群间的接触和黏附，调节白细胞的功能活性和免疫反应。中性粒细胞的吞噬作用、T淋巴细胞的识别抗原及活化、靶细胞的杀伤、T淋巴细胞对B淋巴细胞的激活及诱导分化、抗体形成等过程均与之有关系(GemmellE等1994)。近年来对基因调控的深入研究证实，肿瘤的发生是由众多基因参与的信号传导过程，其中细胞黏附分子介导的细胞间相互作用对于肿瘤的形成和转移至关重要，恶性肿瘤细胞表达不同的黏附分子，黏附机制的失调在肿瘤的发生和转移中起重要的作用(徐斌等，2001)。ICAM-1在一类高侵袭性乳腺癌细胞中高水平表达而成为分子标记(Guo等,2014)。肺癌中ICAM-1也因为高水平表达而成为癌症诊断评估的重要手段(Kotteas等,2014)。ICAM-1在急性排斥反应中起着重要的介导作用，肾移植术后，sICAM-1在血和尿中的含量呈规律性变化(TeppoAM，2001；ErikssonBM等，2001)，ICAM-1还介导APC与抗原特异性T细胞的相互作用以及细胞毒性T细胞和靶细胞的相互作用,其表达水平一般与肝细胞损伤程度呈正比(MarteliusT等，2000)在冠状动脉病变进展阶段,在血清中可检测到ICAM-1水平增高(LuHH等，2010)。糖尿病模型中ICAM-1在大脑内皮细胞和表层神经原的表达量都增加(Jing等,2014)。总之，ICAM-1在促进炎症部位的黏连性，控制肿瘤恶化和转移以及调节机体免疫反应中起重要作用。白细胞通过整合素精细调控与ICAM-1的相互作用实现免疫信号传递。整合素是含有α和β两个亚基的复杂蛋白体；野生型整合素在细胞表面活性低，受到激发后构象发生变化(或称Allostery)，与受体亲和力提高，实现信号传递。LFA-1L亚基的插入结构域(Inserteddomain,Idomain)介导与受体ICAM-1结合，其自身也存在构象变化(图2；Luo等,2007)。为克服蛋白构象瞬息变化带来的研究困难，科学家通过各种手段锁定与受体高亲和结合的Idomain突变体。利用酵母展示技术筛选到比野生型亲和性高20万倍的LFA-1突变体(Jin等,2006)。这些突变体的筛选能够为药物精确释放等应用打下了坚实的基础(Kang等,2011)。ICAM-1在炎症以及各类疾病中的重要角色，使其成为重要药物开发靶点。ICAM-1单克隆抗体14C11能够抑制人鼻病毒侵染引起的肺部炎症恶化(Traub等,2013)。LFA-1αLIdomain与ICAM-1亲和力强而且分子量小，因此LFA-1也是药物靶点。LFA-1适宜作为白血病治疗靶标以及药物释放载体(Phongpradist等,2010)。从化合物文库筛选到抑制LFA-1和ICAM-1结合的小分子也有药物开发潜力(Kollmann等,2014)。抑制ICAM-1相关信号途径也是药物开发重点。研究表明，抑制脑内皮细胞ICAM-1信号传递途径的药物在实验动物尚有效干预了脑内炎症的发展(Turowski等，2005)。靶向TNF核酸反义抑制的纳米颗粒能有效抑制肠道炎症(Wilson等,2010)。抑制PKC的药物能改善2型糖尿病的不良症状，减轻炎症因子表达等(Farese等,2014)。一些中药成分也通过ICAM-1相关的细胞因子、黏附分子以及NF-kB途径而发挥作用(李姗姗和朱英,2012)。以上例证表明，ICMA-1及其关联的信号途径的众多蛋白都是潜在药物靶点。
技术实现思路
申请人利用Jing(JinM,SongG,CarmanCV,etal.DirectedevolutiontoprobeproteinallosteryandintegrinIdomainsof200,000-foldhigheraffinity[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2006,103(15):5758-5763.)筛选到的人LFA-1αLIdomain的高亲和突变体(F265S/F292G)、不亲合性突变体(D137A)以及野生型(WT)基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于ICAM‑1信号通路的高通量药物筛选模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)工程化酵母的构建和验证：在启动子GAL10的后面依次连接分泌信号肽SS、α‑半乳糖苷酶Aga2基因、人LFA‑1 αL I domain基因和Flag标签，使人LFA‑1 αL I domain胞外域、Flag标签和α半乳糖苷酶Aga2基因的N端到C端区域同时展示于EBY100酵母细胞的表面；在启动子GAL1的后面依次连接有GFP荧光蛋白基因和Myc标签，使其能够在酵母细胞的胞内表达GFP绿色荧光蛋白，用于指示酵母数量，得到双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3‑intre‑huαL Idwt‑wGFP，pDV3‑intre‑huαL Id D137A‑wGFP和pDV3‑intre‑huαL Id F265S/F292G‑wGFP；所述的启动子GAL10的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述的分泌信号肽SS的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述的α‑半乳糖苷酶Aga2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述的人LFA‑1 αL I domain基因为三个，即wt、D137A、F265S/F267G，其中wt的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，D137A的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；F265S/F267G的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述的Flag标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；所述的启动子GAL1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述的GFP荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述的Myc标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；所述的双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3‑intre‑huαL Idwt‑wGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；pDV3‑intre‑huαL Id D137A‑wGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；pDV3‑intre‑huαL Id F265S/F292G‑wGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；将所述的三个双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3‑intre‑huαL Idwt‑wGFP、pDV3‑intre‑huαL Id D137A‑wGFP和pDV3‑intre‑huαL Id F265S/F292G‑wGFP以PEG/LiAc方法和一个质粒载体对应一个酵母细胞方式分别导入酵母细胞EBY100中，得到三个重组酵母细胞，培养这三个重组酵母细胞并诱导表达，得到表面展示有目标蛋白的酵母细胞后，用流式细胞仪检测人LFA‑1 αL I domain和GFP荧光蛋白是否表达；(2)哺乳动物细胞炎症模型的构建和验证：将人微血管内皮细胞HMEC‑1接种到细胞培养板中，待细胞长至80％时经细菌脂多糖(LPS)诱导3h后，用qRT‑PCR方法检测ICAM‑1基因的表达量；诱导12h后用抗ICAM‑1单克隆抗体LB‑2通过流式细胞仪检测ICAM‑1蛋白的表达量；同时用1μM的雷公藤红素处理3h后，再经LPS诱导3h后用qRT‑PCR检测炎症因子基因MCP‑1、ICAM‑1、VCAM‑1和E‑selectin的表达量，诱导12h后用抗ICAM‑1单克隆抗体LB‑2通过流式细胞仪检测ICAM‑1蛋白的表达量；(3)高通量药物筛选模型的构建和验证：以1uM雷公藤红素作为抗炎活性检测的阳性药物，将HMEC‑1细胞接种到细胞培养板中，当HMEC‑1细胞生长至80％时，加入1μM雷公藤红素处理3h，加入1ug/ml的LPS，诱导12h后，加入适量的表达LFA‑1hu aL I domain蛋白和GFP蛋白的EBY100酵母细胞，在室温下于120rpm/h动态结合1h，用PH为7.4的缓冲溶液B洗涤3遍后，在光学显微镜下观察每个处理组的酵母细胞数，在荧光显微镜下观察每个处理组EBY100酵母细胞与HMEC‑1细胞的结合情况；用酶标仪统计每孔荧光强度；用1μM的地塞米松、100μg/ml的氢化可的松并参照上述雷公藤红素的处理步骤再处理一遍；以未经LPS处理的HMEC‑1细胞与Wt、D137A不敏感型酵母细胞为对照；其中：所述的缓冲液B配比如下：磷酸盐缓冲液(PBS)+0.5％牛血清白蛋白+10mM MgCl2。...
【技术特征摘要】
1.一种基于ICAM-1信号通路的高通量药物筛选模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)工程化酵母的构建和验证：在启动子GAL10的后面依次连接分泌信号肽SS、α-半乳糖苷酶Aga2基因、人LFA-1αLIdomain基因和Flag标签，使人LFA-1αLIdomain胞外域、Flag标签和α半乳糖苷酶Aga2基因的N端到C端区域同时展示于EBY100酵母细胞的表面；在启动子GAL1的后面依次连接有GFP荧光蛋白基因和Myc标签，使其能够在酵母细胞的胞内表达GFP绿色荧光蛋白，用于指示酵母数量，得到双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-huαLIdwt-wGFP，pDV3-intre-huαLIdD137A-wGFP和pDV3-intre-huαLIdF265S/F292G-wGFP；所述的启动子GAL10的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；所述的分泌信号肽SS的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示；所述的α-半乳糖苷酶Aga2基因的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；所述的人LFA-1αLIdomain基因为三个，即wt、D137A、F265S/F267G，其中wt的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，D137A的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；F265S/F267G的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；所述的Flag标签的核苷酸序列如SEQIDNO：9所示；所述的启动子GAL1的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；所述的GFP荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述的Myc标签的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；所述的双通道蛋白表达工程酵母的质粒载体pDV3-intre-huαLIdwt-wGFP的核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；pDV3-intre-huαLIdD137A-wGFP的核苷酸序列如SEQIDNO：13所示；pDV3-intre-huαLIdF265S/F292G-wGFP的核苷酸序列如SEQIDNO：14所示；将所述的三个双通道蛋白表达工程酵母的质粒载...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡学博，张启云，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。