高稳定性的人源化抗人CD3单链抗体及其制法和应用制造技术

本发明专利技术提供了一种高稳定性的人源化抗人CD3单链抗体12F6及其制法和应用。本发明专利技术的12F6的部分氨基酸残基发生了突变，引起了其稳定性的提高。本发明专利技术的12F6不仅可用于研究高亲和性TCR与人源化抗人CD3单链抗体融合蛋白(ImmTAC)介导的肿瘤免疫治疗，还可用做其他单链抗体的稳定性优化骨架。

Highly stable humanized anti human CD3 scFv and its preparation and Application

The invention provides a highly stable humanized anti human CD3 single chain antibody 12F6, and its preparation and application. Some of the amino acid residues of 12F6 in the invention have been mutated, resulting in the improvement of their stability. The 12F6 of the present invention can not only be used to study the tumor immunotherapy mediated by high affinity TCR and humanized human anti human CD3 single chain antibody fusion protein (ImmTAC), but also can be used as the stability optimization skeleton of other single chain antibodies.

【技术实现步骤摘要】
高稳定性的人源化抗人CD3单链抗体及其制法和应用
本专利技术涉及生物技术和医学领域，更具体地涉及氨基酸残基突变的、高稳定性的人源化抗人CD3单链抗体。本专利技术还涉及所述单链抗体的制法和用途。
技术介绍
抗体作为重要的生物大分子，在分子生物学，生物化学以及医学检验领域得以广泛应用，其在治疗各种恶性肿瘤方面有着非常重要的作用。自二十世纪七十年代中期杂交瘤技术诞生(Kohler&Milstein等，(1975)，自然(Nature)256(5517):495-497)到1986年第一个单抗正式用于临床治疗(Jaffers等，(1986)，(Transplantation)41(5):572-578)，再到2013年Herceptin与化疗药物Emtansine偶联的首个ADC单抗，以及新近获批的治疗黑色素瘤单抗Nivolumab，已经有41个治疗性抗体药物通过FDA批准上市，同时有超过300种抗体产品正处于临床试验阶段，每年创造超过千亿的销售额(Leavy等，(2010)，(NatRevImmunol)10(5):297)。在二十一世纪的今天，抗体已成为医药行业的绝对优势组成，具有十分广阔的发展前景。目前，抗人CD3单克隆抗体已然成为医药行业研究的热点，因其能够与T细胞表面的CD3分子结合，启动T细胞信号传导级联反应，从而非特异的引起T细胞的杀伤反应。这一特性已经被广泛的应用到各种恶性肿瘤，自身免疫性疾病，移植排斥反应等多个领域的疾病治疗当中。全球第一个被美国食品药品监督管理局(FDA)批准的用于治疗急性器官移植排斥的抗体药物OKT3单克隆抗体就是鼠抗人CD3抗体(Jaffers等，(1986)，(Transplantation)41(5):572-578)。随后，鼠源抗体12F6和UCHT-1等陆续被开发，它们与OKT3识别同一抗原位点。如上所述，鼠抗人CD3抗体具有相当大的免疫治疗潜力，但是这些抗体的价值受到了两个关键因素的制约。其一，是人抗鼠抗体反应，该反应可加速鼠源抗体的清除，有时还会引起过敏反应。其二，是首剂综合症，给药后病人可出现一系列从轻度的发热、发冷到重度水肿的症状，偶尔甚至会出现“细胞因子风暴”引起致死。引起这一严重后果是因为T细胞表面的CD3分子与抗体的Fc段交联引发一系列级联反应。在抗体分析结构改造中，不可避免的会引起抗体稳定性的降低。因此，克服这两个关键制约因素成为抗人CD3抗体发展的整体趋势，首先就是对鼠源抗体进行人源化，然后就是去除抗体的Fc段。因此，本领域技术人员致力于开发稳定性好、亲和力高的抗人CD3抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高稳定性的人源化抗人CD3单链抗体。本专利技术的第一方面，提供了一种抗人CD3抗体，所述抗人CD3抗体的氨基酸序列基于SEQIDNO.1所示抗体的氨基酸序列，并且对SEQIDNO.1所示抗体的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的突变从而获得所述抗人CD3抗体；并且所述抗人CD3抗体的氨基酸序列与SEQIDNO.1所示抗体的氨基酸序列有至少90％的序列相同性；并且所述抗人CD3抗体的Tm值高于SEQIDNO.1所示抗体的Tm至少5℃，优选地至少8℃，更优选地至少10℃。在另一优选例中，所述抗人CD3抗体的Tm值≥65℃；优选地≥70℃；更优选地≥73℃；最优选地≥75℃。在另一优选例中，所述抗人CD3抗体中突变的氨基酸残基位点为1、33、75-76、95-110、135-150、188-195、205-220、240-245位氨基酸残基中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号。在另一优选例中，所述抗人CD3抗体中突变的氨基酸残基位点为1D，33H，75S，76S，99Q，102K，104E，107R，137V，139Q，141G，142R，145R，190F，194F，208Q，210D，213R，215E，241V，和243V中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号。在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点的数量为n，其中1≤n≤20；优选地，2≤n≤15；更优选地，2≤n≤11，如n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点包括1D，和/或33H，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号。在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点还包括75S，和/或76S。在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点还包括99Q，102K，104E，和/或107R。在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点还包括137V，139Q，141G，142R，和/或145R。在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点还包括190F，和/或194F。在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点还包括208Q，210D，213R，和/或215E。在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点还包括241V，和/或243V。在另一优选例中，所述抗人CD3抗体包括选自下组的一个或多个突变后的氨基酸残基：1G，33N，75N，76K，99N，102H，104K，107N，137K或137Q，139N、139K、139D或139E，141E、141Q、141D或141K，142K、142Q、142E或142N，145K或145Q，190L，194V，208D或208N，210E或210N，213E、213H或213K，215D或215N，241I，243F，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO:1所示的编号。在另一优选例中，所述抗人CD3抗体包括突变后的氨基酸残基：1G，和/或33N。在另一优选例中，所述抗人CD3抗体包括突变后的氨基酸残基：75N，和/或76K。在另一优选例中，所述抗人CD3抗体包括突变后的氨基酸残基：99N，102H，104K，和/或107N。在另一优选例中，所述抗人CD3抗体包括突变后的氨基酸残基：137K或137Q，139N、139K、139D或139E，141E、141Q、141D或141K，142K、142Q、142E或142N，和/或，145K或145Q。在另一优选例中，所述抗人CD3抗体包括突变后的氨基酸残基：190L，和/或194V。在另一优选例中，所述抗人CD3抗体包括突变后的氨基酸残基：208D或208N，210E或210N，213E、213H或213K，和/或，215D或215N。在另一优选例中，所述抗人CD3抗体包括突变后的氨基酸残基：241I，和/或243F。在另一优选例中，所述抗人CD3抗体中氨基酸残基的突变为：(ⅰ)D1G、H33N、Q99N、K102H、E104K、R107N、Q208D、D210E、R213H和E215D；(ⅱ)D1G、H33N、V137K、Q139D、G141D、R142E和R145K；(ⅲ)D1G、H33N、V137K、Q139E、G141K、R142N和R145K；(ⅳ)D1G、H33N、S75N、S76K、Q208D、D210N、R213H、E215D和V243F；(ⅴ)D1G、H33N、V137K、Q139K、G141Q、R142Q、R145Q、Q208D、D210N、R213K和E215N；(ⅵ)D1G、H33N、V137Q、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗人CD3抗体，其特征在于，所述抗人CD3抗体的氨基酸序列基于SEQ ID NO.1所示抗体的氨基酸序列，并且对SEQ ID NO.1所示抗体的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的突变从而获得所述抗人CD3抗体；并且所述抗人CD3抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示抗体的氨基酸序列有至少90％的序列相同性；并且所述抗人CD3抗体的Tm值高于SEQ ID NO.1所示抗体的Tm至少5℃，优选地至少8℃，更优选地至少10℃；优选地，所述抗人CD3抗体中突变的氨基酸残基位点为1、33、75‑76、95‑110、135‑150、188‑195、205‑220、240‑245位氨基酸残基中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号；更优选地，所述抗人CD3抗体中突变的氨基酸残基位点为1D，33H，75S，76S，99Q，102K，104E，107R，137V，139Q，141G，142R，145R，190F，194F，208Q，210D，213R，215E，241V，和243V中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。

【技术特征摘要】
1.一种抗人CD3抗体，其特征在于，所述抗人CD3抗体的氨基酸序列基于SEQIDNO.1所示抗体的氨基酸序列，并且对SEQIDNO.1所示抗体的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的突变从而获得所述抗人CD3抗体；并且所述抗人CD3抗体的氨基酸序列与SEQIDNO.1所示抗体的氨基酸序列有至少90％的序列相同性；并且所述抗人CD3抗体的Tm值高于SEQIDNO.1所示抗体的Tm至少5℃，优选地至少8℃，更优选地至少10℃；优选地，所述抗人CD3抗体中突变的氨基酸残基位点为1、33、75-76、95-110、135-150、188-195、205-220、240-245位氨基酸残基中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号；更优选地，所述抗人CD3抗体中突变的氨基酸残基位点为1D，33H，75S，76S，99Q，102K，104E，107R，137V，139Q，141G，142R，145R，190F，194F，208Q，210D，213R，215E，241V，和243V中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号。2.如权利要求1所述的抗人CD3抗体，其特征在于，突变的氨基酸残基位点包括1D，和/或33H，其中氨基酸残基编号采用SEQIDNO.1所示的编号；优选地，突变的氨基酸残基位点还包括75S，和/或76S；和/或突变的氨基酸残基位点还包括99Q，102K，104E，和/或107R；和/或突变的氨基酸残基位点还包括137V，139Q，141G，142R，和/或145R；和/或突变的氨基酸残基位点还包括190F，和/或194F；和/或突变的氨基酸残基位点还包括208Q，210D，213R，和/或215E；和/或突变的氨基酸残基位点还包括241V，和/或243V。3.如权利要求1所述的抗人CD3抗体，其特征在于，所述抗人CD3抗体包括选自下组的一个或多个突变后的氨基酸残基：1G，33N，75N，76K，99N，102H，104K，107N，137K或137Q，139N、139K、139D或139E，141E、141Q、141D或141K，142K、142Q、142E或142N，1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李懿，刘强，田野，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44