一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法技术

本发明专利技术涉及蛋白纯化领域，特别涉及一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，包括以下步骤：采用第一缓冲液对阴离子交换层析柱进行预处理，然后将待纯化样品上样；第一缓冲液洗涤阴离子交换层析柱，至波长为280nm的吸光度数值开始明显上扬并平稳；梯度洗脱阴离子交换层析柱，收集第一洗脱液；第一洗脱液上样于第二缓冲液预处理后的疏水层析柱，梯度液洗脱疏水层析柱，收集第二洗脱液；进行膜包过滤，得到的滤液即为纯化的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白。该方法先使用柱层析的方法，然后再进行膜包过滤，整个过程需要10h左右，具有纯化时间短，纯化效率高，收率为80％‑85％，SDS检测无杂带，纯化效果好。

Purification method of Pasteurella multocida toxin protein

The invention relates to the field of protein purification, in particular to a purification method of a Pasteurella protein of multiple killing sex, including the following steps: the first buffer solution is used to pretreat the anion exchange chromatography column, and then the sample will be purified, and the first buffer liquid is washed by the anion exchange chromatography column, to the absorption of the wavelength of 280nm. A gradient elution anion exchange chromatography column was used to collect the first eluate; the first eluent was pretreated with a hydrophobic column after second buffers, the gradient solution eluted the hydrophobic column, and collected second eluents, and the filtrate obtained was the purified multi kill pasteuri. Bacilli toxin protein. The method first used column chromatography and then carried out membrane filtration. The whole process needed about 10h. The purification time was short, the purification efficiency was high, the yield was 80% 85%, the SDS was no miscellaneous band, and the purification effect was good.

【技术实现步骤摘要】
一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法
本专利技术涉及蛋白纯化领域，具体而言，涉及一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法。
技术介绍
多杀性巴氏杆菌毒素占多杀性巴氏杆菌细菌总蛋白量的1％左右，由于杂蛋白含量极多，大量的杂蛋白极大的影响了毒素灭活以及引起疫苗副反应等问题。大量制备纯化多杀性巴氏杆菌毒素是配制猪萎缩性鼻炎灭活疫苗中极其重要的一步。目前国内尚无相关类毒素产品上市，也没有生产相关类毒素的大量纯化技术的报道。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，该方法纯化过程简单，时间短，纯化效率高，回收率在80％以上，纯化效果佳。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，包括以下步骤：(a)、采用第一缓冲液对阴离子交换层析柱进行预处理，然后将待纯化样品上样；(b)、所述第一缓冲液洗涤所述阴离子交换层析柱，至波长为280nm的吸光度数值开始明显上扬并平稳；(c)、采用所述第一缓冲液和第二缓冲液的混合液梯度洗脱所述阴离子交换层析柱，所述第二缓冲液的体积百分数为55％-70％，收集第一洗脱液；(d)、所述第一洗脱液上样于所述第二缓冲液预处理后的疏水层析柱，采用所述第一缓冲液和第二缓冲液的混合液梯度液洗脱所述疏水层析柱，所述第一缓冲液的体积百分数为40％-65％，收集第二洗脱液；(e)、所述第二洗脱液进行膜包过滤，得到的滤液即为纯化的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白；所述第一缓冲液为pH为8.0±0.2的50±2mMTris溶液；所述第二缓冲液含有50±2mMTris和1±0.2MNaCl，pH为8.0±0.2。本专利技术提供的一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，先使用柱层析的方法，仅需两步即可对多杀性巴氏杆菌细菌总蛋白进行纯化，纯化时间约8h；然后再进行膜包过滤，约1h即可完成。整个过程需要10h左右，而直接用膜包进行处理则需要170h左右，并且纯化后还含有较多的杂蛋白。可见，本专利技术提供的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，具有纯化时间短，纯化效率高，收率为80％-85％，SDS检测无杂带，纯化效果好。本专利技术中，柱子的预处理包括洗涤和平衡的步骤。本专利技术中，波长为280nm的吸光度即紫外光在特定波长下的数值，是对样品照射后的吸光度，能够反映出被照射样品的属性。进一步地，所述阴离子交换层析柱为阴离子交换层析柱MAXQ-H。优选地，步骤(a)中，上样的速度为2±0.2mL/min。通过适当的上样速度，使得目标蛋白充分挂到柱子上。第一缓冲液在阴离子交换层析柱上洗涤很重要，因为这一步样品中杂蛋白以及其他杂质较多，不洗涤的话会直接影响阴离子交换层析柱的回收样品的纯净度。进一步地，步骤(b)中，所述第一缓冲液洗涤所述阴离子交换层析柱的速度为2-4mL/min，优选为2-2.5mL/min。进一步地，步骤(c)中，洗脱的速度为1.5±0.2mL/min。这一步样品量很大，杂蛋白也很多，无法去除所有杂蛋白，所以，先快速去除一部分即可。综合考虑洗脱效果和时间，选用该洗脱速度。进一步地，所述疏水层析柱为疏水层析柱MAXpheny1。进一步地，步骤(d)中，上样的速度为2±0.2mL/min。通过适当的上样速度，使得目标蛋白充分挂到柱子上。上样后，可以选用第二缓冲液洗涤疏水层析柱，也不可以不洗涤。优选地，步骤(d)中，洗脱的速度为1±0.2mL/min。综合考虑洗脱效果和时间，选用该洗脱速度，通过低速洗脱，得到纯化的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白。进一步地，步骤(e)中，所用的膜包为100kD膜包，所述膜包过滤时的流速10±1mL/min，膜包过滤过程中关闭流穿阀，仅收集滤液。进一步地，所述阴离子交换层析柱与所述疏水层析柱的容量均为50mL，所述待纯化样品的浓度为150-250μg/mL，体积为5L，步骤(c)中,所述第一洗脱液与待纯化样品的体积比为1:8-10；步骤(d)中，所述第一洗脱液与所述第二洗脱液的体积比为1:1±0.2。经多次试验筛选，在阴离子交换层析柱进行该梯度洗涤的效果佳，进一步地，步骤(c)中，梯度洗涤中，所述第二缓冲液在不同时间段的体积百分比为：0-10min为55％-60％，10-60min为60％-65％，60-150min为65％-70％，150-240min为70％。经多次试验筛选，在疏水层析柱进行该梯度洗涤的效果佳，进一步地，步骤(d)中，梯度洗涤中，所述第一缓冲液在不同时间段的体积百分比为：0-20min为40％-45％，20-80min为45％-50％，80-140min为50％-55％，140-200min为55％-60％，200-240min为60％-65％。另外，本专利技术收集的第二洗脱液可用100倍体积PBS缓冲液稀释，即可获得原倍多杀性巴氏杆菌毒素纯化样品。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术提供的一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，先使用柱层析的方法，增加两步进行纯化后，再进行膜包处理，大幅度缩短时间。(2)本专利技术提供的一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，选用特定的阴离子交换层析柱和疏水层析柱，柱子纯化效率高，收率为80％左右，纯化效果好，SDS检测无杂带。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本专利技术实施例1不同洗脱液洗脱阴离子交换层析柱收集的洗脱液的电泳图；图2为本专利技术实施例1不同洗脱液洗脱疏水层析柱收集的洗脱液的电泳图；图3为本专利技术实施例1膜包处理后收集的滤液的电泳图；图4为本专利技术对比例1膜包纯化法收集的纯化液体的电泳图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1一种多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)的纯化方法，包括以下步骤：1.试验材料AKTApurifier蛋白纯化仪、电泳仪、pH计、电导仪、15mL离心管、阴离子交换层析柱MAXQ-H一根(50mL)、疏水交换层析株MAXpheny1一根(50mL)、10倍浓缩粗提多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)5L。2.试验缓冲液bufferA:50mMTris，pH8.0；bufferB:50mMTris，1MNaCl，pH8.0。3.纯化过程3.1阴离子交换层析连接阴离子交换层析柱于蛋白纯化仪上，使用阴离子交换层析缓冲液bufferA对层析柱进行洗涤、平衡。当柱内pH值与电导值稳定后准备上样。调节待纯化样品10倍浓缩多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)粗提液的pH值和电导值与阴离子交换层析缓冲液bufferA相同。按照2mL/min上样，上样量为5L。上样结束后使用bufferA洗涤杂蛋白，洗涤速度为2mL/min，洗涤至λ280值开始明显上扬并平稳。分别施用不同的梯度洗涤阴离子交换层析柱，然后得到的洗脱液进行电泳，结果如图1所示。图1中，E1是5％-25％洗脱液；E2是25％-55％洗脱液；使用55％至70％bufferB梯度清洗阴离子交换层析柱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)、采用第一缓冲液对阴离子交换层析柱进行预处理，然后将待纯化样品上样；(b)、所述第一缓冲液洗涤所述阴离子交换层析柱，至波长为280nm的吸光度数值开始明显上扬并平稳；(c)、采用所述第一缓冲液和第二缓冲液的混合液梯度洗脱所述阴离子交换层析柱，所述第二缓冲液的体积百分数为55％‑70％，收集第一洗脱液；(d)、所述第一洗脱液上样于所述第二缓冲液预处理后的疏水层析柱，采用所述第一缓冲液和第二缓冲液的混合液梯度液洗脱所述疏水层析柱，所述第一缓冲液的体积百分数为40％‑65％，收集第二洗脱液；(e)、所述第二洗脱液进行膜包过滤，得到的滤液即为纯化的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白；所述第一缓冲液为pH为8.0±0.2的50±2mM Tris溶液；所述第二缓冲液含有50±2mM Tris和1±0.2M NaCl，pH为8.0±0.2。

【技术特征摘要】
1.一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)、采用第一缓冲液对阴离子交换层析柱进行预处理，然后将待纯化样品上样；(b)、所述第一缓冲液洗涤所述阴离子交换层析柱，至波长为280nm的吸光度数值开始明显上扬并平稳；(c)、采用所述第一缓冲液和第二缓冲液的混合液梯度洗脱所述阴离子交换层析柱，所述第二缓冲液的体积百分数为55％-70％，收集第一洗脱液；(d)、所述第一洗脱液上样于所述第二缓冲液预处理后的疏水层析柱，采用所述第一缓冲液和第二缓冲液的混合液梯度液洗脱所述疏水层析柱，所述第一缓冲液的体积百分数为40％-65％，收集第二洗脱液；(e)、所述第二洗脱液进行膜包过滤，得到的滤液即为纯化的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白；所述第一缓冲液为pH为8.0±0.2的50±2mMTris溶液；所述第二缓冲液含有50±2mMTris和1±0.2MNaCl，pH为8.0±0.2。2.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换层析柱为阴离子交换层析柱MAXQ-H。3.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(a)中，上样的速度为2±0.2mL/min。4.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(c)中，洗脱的速度为1.5±0.2mL/min。5.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，其特征在于，所述疏水层析柱...

【专利技术属性】
技术研发人员：何海，郝成武，韩瑞，
申请(专利权)人：天康生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：新疆,65