一种普利卡那肽的固相合成方法技术

本发明专利技术涉及医药领域产品普利卡那肽的合成方法。该方法采用固液相相合成方法合成普利卡那肽，经过裂解直接获得普利卡那肽粗品，经过纯化得到产品。本发明专利技术先采用液相合成法合成六肽片段，利用酶促法将六肽片段偶联至固相树脂上，利用固相树脂的假稀释效应在固相树脂上通过对Cys不同位置的保护基，直接完成两个二硫环的选择性合成，之后将其从树脂上切割下来，直接进行纯化。由于液相、固相同时开展合成，酶促合成大大提高了合成效率及合成收率，不仅极大的减少了废水、废有机溶剂、废气的产生，同时固液相合成大大降低了生产成本，提高了产品品质。

A solid phase synthesis of pulica

The invention relates to a method for the synthesis of plica peptide in the field of medicine. In this method, plica was synthesized by solid-liquid phase synthesis. After purification, the product was purified and purified. In this invention, the six peptide fragment was synthesized by liquid phase synthesis, and the six peptide fragment was coupled to the solid phase resin by enzymatic method. By using the false dilution effect of solid resin on the solid resin, the selective synthesis of two two sulfur rings was completed directly through the protective basis of different positions of Cys, and then the resin was cut from the resin directly. Purify. Because of the simultaneous synthesis of liquid and solid phase, enzymatic synthesis greatly improves the synthesis efficiency and synthesis yield, not only greatly reduces the production of waste water, waste organic solvent and waste gas, but also greatly reduces the production cost and improves the quality of the product.

【技术实现步骤摘要】
一种普利卡那肽的固相合成方法
本专利技术为多肽合成制备领域，特别涉及普利卡那肽的合成制备方法。技术背景普利卡那肽结构式如下：H-Asn-Asp-Glu-Cys(1)-Glu-Leu-Cys(2)-Val-Asn-Val-Ala-Cys(1)-Thr-Gly-Cys(2)-Leu-OH-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)普利卡那肽由美国Synergy公司研发成功，并于2017年1月19日获得FDA的批准，该药是一种口服鸟苷酸环化酶C(GC-C)受体激动剂，可以在上消化道发挥作用以刺激分泌肠液，从而维持肠道功能正常。其氨基酸肽序为H-Asn-Asp-Glu-Cys(1)-Glu-Leu-Cys(2)-Val-Asn-Val-Ala-Cys(1)-Thr-Gly-Cys(2)-Leu-OH，其中序列的4号位与10号位，7号位与15号位分别形成两对二硫环。主要用于治疗便秘肠易激综合症(IBS-C)和慢性特发性便秘(CIC)，它是迄今第二个用于治疗便秘的口服多肽药物。当前关于该药物的合成专利不多，主要有深圳翰宇药业的CN201310209459.8和CN201310680490.X两个专利，以及南京工业大学的一个制备专利CN201510104385.0。深圳翰宇药业的两个专利分别采用不同的固液相合成策略，虽然都采用的不同的侧链保护剂，定向合成了两对二硫键，但是由于采用了最后液相环化的方法，合成反应液的浓度受到极大限制，会产生大量的废水，操作复杂麻烦，不适合产业化生产。南京工业大学采用了固相环化的方法，有所改进，但是纯固相合成，需要高倍数物料投入，产生大量原材料的浪费，原子利用率极差，反应时间相对较长。本专利技术收率基本与现有文献报道持平或略高于报道，但是总体时间成本，物料成本等大大降低，并且适用于工业化生产。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的普利卡那肽的固相合成方法，该方法合成效率高，物料成本大大降低，并且适用于工业化生产。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本专利技术是一种普利卡那肽的固相合成方法，其特点是：先采用液相合成法合成六肽片段，利用酶促法将六肽片段偶联至固相树脂上，利用固相树脂的假稀释效应在固相树脂上通过对Cys不同位置的保护基，直接完成两个二硫环的选择性合成，之后将其从树脂上切割下来，直接进行纯化。本专利技术所述的一种普利卡那肽的固相合成方法，其进一步优选的技术方案步骤是：A、片段缩合成各类普利卡那肽中间体：(1)R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3的合成；（2）利用树脂的假稀释效应完成R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic(4→12)-disulfide的合成，4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚键环；(3)R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的合成；4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚环基础上，7号位和15号位的两个半胱氨酸再成硫醚环；各类氨基酸保护基中：R为Z、Boc、Cl-Z、Fmoc、oNBS、dNBS、Troc、Dts、pNZ、oNZ、NVOC、NPPOC、HFA、Ddz、Bpoc、Nps、Nsc、Bsmoc、α-Nsmoc、ivDde、Fmoc*、MTT、Alloc其中任意一个；R1为Meb、Mob、TRT、Tmob、Mmt、Xan、Pmbf、Bn、tBu、Fm、Dnpe、Fmoc、Acm、Phacm、StBu、Npys、Alloc其中任意一个；R2为H、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb其中任意一个；R3为H、OMe、Oet、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb、wang树脂、CTC树脂其中任意一个；R4为Bn、cHx、tBu、Trt、TBDMS、Dmnb、Poc其中任意一个；B、普利卡那肽粗肽的合成；H-Asn-Asp-Glu-Cys(1)-Glu-Leu-Cys(2)-Val-Asn-Val-Ala-Cys(1)-Thr-Gly-Cys(2)-Leu-OH-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)C、普利卡那肽的纯化和冻干。本专利技术中的相关名词解释如下：本专利技术所述的普利卡那肽的固相合成方法，其进一步优选的技术方案是：固相合成过程中用到的偶联体系为：（1）、单一缩合剂：DIC、EDC、氯乙酰氯、氯甲酸乙酯、氯甲酸叔丁酯、氯甲酸异丁酯、TBTU、PyBOP、HBTU、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶；（2）二体系缩合剂：DIC/HOBT、EDC/HOBT、DIC/HOSu、EDC/HOSu；（3）环合试剂：哌啶/DMF、H2O2/DMF、I2/DMF、DMSO/DMF、H2O2/H2O、I2/H2O、DMSO/H2O；本专利技术所述的普利卡那肽的固相合成方法，其进一步优选的技术方案是：R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的合成具体步骤如下：（1）以Fmoc-Leu-OH为第一个氨基酸，与wang树脂或CTC树脂，涉及的树脂替代度优选从0.2mmol/g~1.8mmol/g进行缩合形成Fmoc-Leu-树脂，然后通过逐个偶联氨基酸的方法，偶联完成10个氨基酸树脂；之后将液相方法合成的R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-R3采用木瓜蛋白酶直接偶联到肽树脂上，完成全保护肽树脂的合成；（2）、R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic(4→12)，disulfide的合成采用4号位、12号位Mmt或者ACM保护的半胱氨酸，用不同浓度的TFA进行裂解，脱除Mmt或者ACM后，用DMSO、空气、双氧水等氧化剂中的一种或者组合物进行氧化成环，获得目标产品；（3）、R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-V本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种普利卡那肽的固相合成方法，其特征在于：先采用液相合成法合成六肽片段，利用酶促法将六肽片段偶联至固相树脂上，利用固相树脂的假稀释效应在固相树脂上通过对Cys不同位置的保护基，直接完成两个二硫环的选择性合成，之后将其从树脂上切割下来，直接进行纯化。

【技术特征摘要】
1.一种普利卡那肽的固相合成方法，其特征在于：先采用液相合成法合成六肽片段，利用酶促法将六肽片段偶联至固相树脂上，利用固相树脂的假稀释效应在固相树脂上通过对Cys不同位置的保护基，直接完成两个二硫环的选择性合成，之后将其从树脂上切割下来，直接进行纯化。2.根据权利要求1所述的一种普利卡那肽的固相合成方法，其特征在于，其步骤是：A、片段缩合成各类普利卡那肽中间体：(1)R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3的合成；（2）利用树脂的假稀释效应完成R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic(4→12)-disulfide的合成，4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚键环；(3)R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic(4→12),(7→15)-bis(disulfide)的合成；4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚环基础上，7号位和15号位的两个半胱氨酸再成硫醚环；各类氨基酸保护基中：R为Z、Boc、Cl-Z、Fmoc、oNBS、dNBS、Troc、Dts、pNZ、oNZ、NVOC、NPPOC、HFA、Ddz、Bpoc、Nps、Nsc、Bsmoc、α-Nsmoc、ivDde、Fmoc*、MTT、Alloc其中任意一个；R1为Meb、Mob、TRT、Tmob、Mmt、Xan、Pmbf、Bn、tBu、Fm、Dnpe、Fmoc、Acm、Phacm、StBu、Npys、Alloc其中任意一个；R2为H、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb其中任意一个；R3为H、OMe、Oet、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb、wang树脂、CTC树脂其中任意一个；R4为Bn、cHx、tBu、Trt、TBDMS、Dmnb、Poc其中任意一个；B、普利卡那肽粗肽的合成；C、普利卡那肽的纯化和冻干。3.根据权利要求1或2所述的普利卡那肽的固相合成方法，其特征如下：固相合成过程中用到的偶联体系为：（1）、单一缩合剂：DIC、EDC、氯乙酰氯、氯甲酸乙酯...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐峰，苏军，谷海涛，周金玉，刘标，孙美禄，
申请(专利权)人：江苏诺泰澳赛诺生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32