使用融合蛋白对TCR重编程的组合物和方法技术

本文提供了T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)、被工程改造成表达一种或多种TFP的T细胞以及使用其治疗包括癌症在内的疾病的方法。

Compositions and methods for reprogramming TCR using fusion protein

This article provides a T cell receptor (TCR) fusion protein (TFP), engineered to be transformed into a T cell expressing one or more TFP, and a method of using it to treat diseases, including cancer.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用融合蛋白对TCR重编程的组合物和方法交叉引用本申请要求2015年5月18日提交的美国临时专利申请号62/163,342的权益，该案以引用的方式整体并入本文中。专利技术背景大多数患有血液恶性疾病或晚期实体肿瘤的患者都无法用标准疗法治愈。此外，传统的治疗选项通常具有严重的副作用。已经作出多种尝试来使患者的免疫系统排斥癌细胞，这种方法统称为癌症免疫疗法。然而，存在的若干障碍使得很难实现临床效用。尽管已经鉴别出数百种所谓的肿瘤抗原，但这些抗原通常是来源于自身，并因此会使癌症免疫疗法针对健康组织，或者具有较差免疫原性。此外，癌细胞使用了多种机制来使其自身不可见或抵抗癌症免疫疗法免疫攻击的起始和传播。近期有关使用嵌合抗原受体(CAR)修饰的自体T细胞疗法的研究在利用免疫系统的能力治疗B细胞恶性疾病方面显示出颇具前景的结果，该疗法依赖于将基因工程改造的T细胞重新引导至癌细胞上的适合细胞表面分子(参见例如，Sadelain等人,CancerDiscovery3:388-398(2013))。利用CD19特异性CART细胞(称为CTL019)得到的临床结果显示，罹患慢性淋巴细胞性白血病(CLL)以及儿童急性淋巴母细胞白血病(ALL)的患者完全缓解(参见例如，Kalos等人,SciTranslMed3:95ra73(2011)；Porter等人,NEJM365:725-733(2011)；Grupp等人,NEJM368:1509-1518(2013))。一种替代方法是使用针对肿瘤相关肽抗原选择的T细胞受体(TCR)α和β链对自体T细胞进行基因工程改造。这些TCR链将形成完整的TCR复合物并且使含TCR的T细胞具有第二种指定的特异性。在患有滑膜癌瘤的患者中，利用表达NY-ESO-1特异性TCRα和β链的工程改造的自体T细胞获得了振奋人心的结果。除表达CAR或第二TCR的基因修饰的T细胞在体外/离体识别并破坏对应靶细胞的能力外，利用工程改造的T细胞的成功患者疗法还需要T细胞能够强活化、扩增、随时间推移持续存在，并且在复发性疾病情况下，实现‘记忆’反应。CART细胞的较高并且可管理的临床功效当前局限于CD19阳性B细胞恶性疾病及表达NY-ESO-1-肽并且表达HLA-A2的滑膜肉瘤患者。显然，需要改善基因工程改造的T细胞以使其更广泛地作用于多种人恶性疾病。本文描述了TCR亚基，包括CD3ε、CD3γ及CD3δ，以及TCRα和TCRβ链与细胞表面抗原特异性结合结构域形成的新型融合蛋白，这些融合蛋白具有克服现有方法的缺点的潜力。本文描述了比CAR更有效地杀灭靶细胞，但释放的促炎性细胞因子量与CAR相当或更少的新型融合蛋白。这些融合蛋白及其使用方法代表了TFP相对于CAR的优势，因为这些细胞因子的水平升高与过继性CAR-T疗法的剂量限制性毒性有关。专利技术概述本文提供了T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)、被工程改造成表达一种或多种TFP的T细胞，以及使用其治疗疾病的方法。在一个方面，本文提供了一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，该融合蛋白包含：TCR亚基，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分，和包含来自CD3ε的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，其中该TCR亚基和该抗体结构域可操作地连接，并且其中该TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。在一个方面，本文提供了一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，该融合蛋白包含：TCR亚基，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分，和包含来自CD3γ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，其中该TCR亚基和该抗体结构域可操作地连接，并且其中该TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。在一个方面，本文提供了一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，该融合蛋白包含：TCR亚基，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分，和包含来自CD3δ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，其中该TCR亚基和该抗体结构域可操作地连接，并且其中该TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。在一个方面，本文提供了一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，该融合蛋白包含：TCR亚基，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分，和包含来自TCRα的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，其中该TCR亚基和该抗体结构域可操作地连接，并且其中该TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。在一个方面，本文提供了一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，该融合蛋白包含：TCR亚基，该TCR亚基包含TCR细胞外结构域的至少一部分，和包含来自TCRβ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，其中该TCR亚基和该抗体结构域可操作地连接，并且其中该TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。在一个方面，本文提供了一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，该融合蛋白包含TCR亚基以及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，该抗原结合结构域是抗CD19结合结构域。在一个方面，本文提供了一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，该融合蛋白包含TCR亚基以及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，该抗原结合结构域是抗B细胞成熟抗原(BCMA)结合结构域。在一些情形中，所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接。在一些情形中，所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。在一些情形中，编码的抗原结合结构域通过连接子序列连接至TCR细胞外结构域。在一些情形中，编码的连接子序列包括(G4S)n，其中n＝1至4。在一些情形中，TCR亚基包含TCR细胞外结构域。在一些情形中，TCR亚基包含TCR跨膜结构域。在一些情形中，TCR亚基包含TCR细胞内结构域。在一些情形中，TCR亚基包含(i)TCR细胞外结构域；(ii)TCR跨膜结构域；及(iii)TCR细胞内结构域，其中(i)、(ii)及(iii)中至少两个是来自同一TCR亚基。在一些情形中，TCR亚基包含含刺激性结构域的TCR细胞内结构域，该刺激性结构域选自CD3ε、CD3γ或CD3δ的细胞内信号传导结构域，或其具有至少一个、两个或三个修饰的氨基酸序列。在一些情形中，TCR亚基包含含刺激性结构域的细胞内结构域，该刺激性结构域选自4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域，或其具有至少一个修饰的氨基酸序列。在一些情形中，所述人或人源化抗体结构域包括抗体片段。在一些情形中，该人或人源化抗体结构域包括scFv或VH结构域。在一些情形中，所述分离的核酸分子编码(i)分别与SEQIDNO:25、SEQIDNO:27及SEQIDNO:29具有70-100％序列同一性的抗CD19轻链结合结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和(ii)包含来自CD3ε的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域；其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接；并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.18 US 62/163,3421.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和(ii)包含来自CD3ε的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域；其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接；并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。2.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和(ii)包含来自CD3γ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域；其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接；并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。3.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和(ii)包含来自CD3δ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域；其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接；并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。4.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和(ii)包含来自TCRα的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域；其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接；并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。5.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR细胞外结构域的至少一部分，和(ii)包含来自TCRβ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的TCR细胞内结构域；及(b)包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域；其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接；并且其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。6.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含TCR亚基以及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，所述抗原结合结构域是抗CD19结合结构域。7.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的重组核酸分子，所述融合蛋白包含TCR亚基以及包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，所述抗原结合结构域是抗B细胞成熟抗原(BCMA)结合结构域。8.根据权利要求6或7所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚基和所述抗体结构域可操作地连接。9.根据权利要求6-8中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TFP当在T细胞中表达时并入TCR中。10.根据权利要求1-9中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述编码的抗原结合结构域通过连接子序列连接至所述TCR细胞外结构域。11.根据权利要求10所述的分离的核酸分子，其中所述编码的连接子序列包括(G4S)n，其中n＝1至4。12.根据权利要求1-11中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚基包含TCR细胞外结构域。13.根据权利要求1-12中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚基包含TCR跨膜结构域。14.根据权利要求1-13中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚基包含TCR细胞内结构域。15.根据权利要求1-14中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚基包含(i)TCR细胞外结构域、(ii)TCR跨膜结构域，及(iii)TCR细胞内结构域，其中(i)、(ii)及(iii)中至少两个是来自同一TCR亚基。16.根据权利要求1-15中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚基包含含刺激性结构域的TCR细胞内结构域，所述刺激性结构域选自CD3ε、CD3γ或CD3δ的细胞内信号传导结构域，或其中具有至少一个修饰的氨基酸序列。17.根据权利要求1-16中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TCR亚基包含含刺激性结构域的细胞内结构域，所述刺激性结构域选自4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域，或其中具有至少一个修饰的氨基酸序列。18.根据权利要求1-17中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述人或人源化抗体结构域包括抗体片段。19.根据权利要求1-18中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述人或人源化抗体结构域包括scFv或VH结构域。20.根据权利要求1-19中任一项所述的分离的核酸分子，所述核酸分子编码(i)分别与SEQIDNO:25、SEQIDNO:27及SEQIDNO:29具有70-100％序列同一性的抗CD19轻链结合结构域氨基酸序列的轻链(LC)CDR1、LCCDR2及LCCDR3，和/或(ii)分别与SEQIDNO:31、SEQIDNO:33及SEQIDNO:35具有70-100％序列同一性的抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链(HC)CDR1、HCCDR2及HCCDR3。21.根据权利要求1-20中任一项所述的分离的核酸分子，所述核酸分子编码轻链可变区，其中所述轻链可变区包含在轻链可变区氨基酸序列SEQIDNO:49中具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列，或与轻链可变区氨基酸序列SEQIDNO:49具有95-99％同一性的序列。22.根据权利要求1-21中任一项所述的分离的核酸分子，所述核酸分子编码重链可变区，其中所述重链可变区包含在重链可变区氨基酸序列SEQIDNO:51中具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列，或与重链可变区氨基酸序列SEQIDNO:51具有95-99％同一性的序列。23.根据权利要求1-19中任一项所述的分离的核酸分子，所述核酸分子编码(i)分别与SEQIDNO:37、SEQIDNO:39及SEQIDNO:41具有70-100％序列同一性的抗BCMA轻链结合结构域氨基酸序列的轻链(LC)CDR1、LCCDR2及LCCDR3，和/或(ii)分别与SEQIDNO:43、SEQIDNO:45及SEQIDNO:47具有70-100％序列同一性的抗BCMA重链结合结构域氨基酸序列的重链(HC)CDR1、HCCDR2及HCCDR3。24.根据权利要求1-19及23中任一项所述的分离的核酸分子，所述核酸分子编码轻链可变区，其中所述轻链可变区包含在轻链可变区氨基酸序列SEQIDNO:53中具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列，或与轻链可变区氨基酸序列SEQIDNO:53具有95-99％同一性的序列。25.根据权利要求1-19、23及24中任一项所述的分离的核酸分子，所述核酸分子编码重链可变区，其中所述重链可变区包含在重链可变区氨基酸序列SEQIDNO:55中具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列，或与重链可变区氨基酸序列SEQIDNO:55具有95-99％同一性的序列。26.根据权利要求1-25中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TFP包含TCR亚基的细胞外结构域，所述细胞外结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。27.根据权利要求1-26中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述编码的TFP包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、其功能片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。28.根据权利要求1-27中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述编码的TFP包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRζ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、其功能片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。29.根据权利要求1-28中任一项所述的分离的核酸分子，其还包含编码共刺激性结构域的序列。30.根据权利要求29所述的分离的核酸分子，其中所述共刺激性结构域是从选自由以下组成的组的蛋白质获得的功能性信号传导结构域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)，以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。31.根据权利要求1-30中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述至少一个但不超过20个修饰包括介导细胞信号传导的氨基酸修饰，或响应于配体结合至所述TFP而磷酸化的氨基酸修饰。32.根据权利要求1-31中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子是mRNA。33.根据权利要求1-32中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述TFP包括TCR亚基的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，所述ITAM包括选自由以下组成的组的蛋白质的ITAM或其部分：CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、TCRζ链、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、其功能片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。34.根据权利要求33所述的分离的核酸分子，其中所述ITAM替代CD3γ、CD3δ或CD3ε的ITAM。35.根据权利要求33所述的分离的核酸分子，其中所述ITAM选自由以下组成的组：CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基及CD3δTCR亚基，并且替代选自由以下组成的组的不同ITAM：CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基及CD3δTCR亚基。36.根据权利要求1-35中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分子包含核苷酸类似物。37.根据权利要求36所述的分离的核酸分子，其中所述核苷酸类似物选自由以下组成的组：2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)修饰的核苷酸、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉基、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸及2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺。38.根据权利要求1-37中任一项所述的分离的核酸分子，其还包含前导序列。39.一种分离的多肽分子，其由如权利要求1-38中任一项所述的核酸分子编码。40.一种分离的重组TFP分子，其包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域。41.一种分离的重组TFP分子，其包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够与内源性TCR复合物和/或至少一种内源性TCR多肽功能性相互作用。42.一种分离的重组TFP分子，其包含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够功能性整合至内源性TCR复合物中。43.根据权利要求40所述的分离的TFP分子，其包括含人或人源化抗CD19结合结构域、TCR细胞外结构域、跨膜结构域及细胞内结构域的抗体或抗体片段。44.根据权利要求40-43中任一项所述的分离的TFP分子，其中所述抗CD19结合结构域是scFv或VH结构域。45.根据权利要求40-44中任一项所述的分离的TFP分子，其中所述抗CD19结合结构域包含与氨基酸序列SEQIDNO:51具有95-100％同一性的重链、其功能片段，或其具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列。46.根据权利要求40-45中任一项所述的分离的TFP分子，其中所述抗CD19结合结构域包含与氨基酸序列SEQIDNO:49具有95-100％同一性的轻链、其功能片段，或其具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列。47.根据权利要求40-46中任一项所述的分离的TFP分子，所述TFP分子包含TCR细胞外结构域，所述细胞外结构域包括选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链...

【专利技术属性】
技术研发人员：帕特里克·博伊尔勒，格雷戈里·西兹克维克兹，罗伯特·霍夫梅斯特，
申请(专利权)人：T细胞受体治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国,US