一种检测PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR引物组制造技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，涉及一种用于检测PCV2、PRV、PRRSV的三重PCR检测方法及寡核苷酸引物对。根据保守序列片段分别设计三对特异性引物，探索最佳反应体系和反应条件，对建立的PCR反应方法进行敏感性试验、特异性试验、重复性试验，并对临床具有发热、呼吸困难、腹泻、神经症状、免疫抑制及种猪繁殖障碍等症状病畜样本进行PCR检测。试验结果表明本研究所建立的三重PCR检测方法具有很好的应用性，能够用于猪圆环病毒病、猪伪狂犬病和猪蓝耳病的检测。

A multiplex PCR primer group for detection of PCV2, PRV and PRRSV

The invention belongs to the field of biological detection technology, and relates to a three heavy PCR detection method and an oligonucleotide primer pair for detecting PCV2, PRV and PRRSV. Three pairs of specific primers were designed according to the conservative sequence, and the best reaction system and reaction conditions were explored. The sensitivity test, specific test and repeatability test of the established PCR reaction method were carried out, and the symptoms of fever, dyspnea, diarrhea, neurologic symptoms, immunosuppression and breeding barriers of pigs were characterized. The samples of the sick animals were detected by PCR. The test results show that the three PCR detection method established in this study is of good application and can be used for the detection of Porcine Circovirus Disease, porcine pseudorabies and porcine blue ear disease.

【技术实现步骤摘要】
一种检测PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR引物组
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种检测PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR引物组及检测方法。
技术介绍
猪圆环病毒病是由猪圆环病毒Ⅱ型引起的猪呼吸道疾病综合征、皮炎肾病综合征、断奶仔猪多系统衰竭以及繁殖障碍等多种症状的传染病。德国学者Tischer在1974首次发现圆环病毒，此后很多国家陆续报道了猪圆环病毒病的发生。猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒引起的主要侵害机体生殖系统和神经系统的传染病。猪繁殖与呼吸障碍综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的呼吸道症状和母猪繁殖障碍的一种急性传染病。猪圆环病毒病、猪伪狂犬病和猪繁殖与呼吸障碍综合征不仅引起猪只高死亡率，而且还会导致机体产生免疫抑制，引起其他病原的继发感染、药物疗效降低及造成疫苗免疫失败，对当前养猪业存在很大的威胁。这三种病均能引起发热、呼吸困难、腹泻、神经症状、免疫抑制及对种猪引起繁殖障碍等临床症状，病理变化和流行病学极为相似，临床上很难区分，因此建立PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR检测方法具有重要意义。PCR是近年来动物疫病最常用的临床检测方法，具有灵敏度高、特异性好等优点，而多重PCR是在单一PCR的基础上加入多对引物，通过对反应条件和程序的不断优化，建立的一种可以在一个反应体系中同时扩增出多个核酸片段的检测方法，可以同时检测多种特定病原的单一或混合感染，具有省时省力，操作简单、快速，且具有很高的特异性和灵敏度，因此有很高的应用价值和前景。但多重PCR的一种关键问题是获得能再一次反应中进行扩增的引物组。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR引物组及检测方法，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种检测PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR引物组，所述的引物组中包含有：检测PCV2的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:1；下游引物的序列为SEQIDNO:2；检测PRV的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:3；下游引物的序列为SEQIDNO:4；检测PRRSV的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:5；下游引物的序列为SEQIDNO:6；本专利技术的引物组用于制备检测PCV2、PRV、PRRSV的试剂盒；本专利技术再一个方面提供一种用于非疾病诊断治疗目的的检测PCV2、PRV、PRRSV的方法，其PCR最佳反应条件：95℃5min；94℃30s，52.1℃35s，72℃30s，循环31次；最后4℃冷却10min。本专利技术通过序列比对，针对基因的同源性序列设计引物，既能保证鉴定病原的正确性，又确保不漏检同种不同株病原，提高检测的特异性。另外，本专利技术的扩增片段长度适宜，三种PCR产物可根据长度明显区分。另外，通过PCR反应体系和反应条件的优化，得到特异性和灵敏性较高的针对特定基因的PCR检测方法。经最终实验证实，本专利技术的PCR检测方法由于引物设计和实验体系的选取，该方法对PCV2的最低检出浓度为4.53×10-5ng/μL，对PRV的最低检出浓度为6.24×10-5ng/μL，对PRRSV的最低检出浓度为6.37×10-5ng/μL。且成本低廉，能够同步快速实现对PCV2、PRV和PRRSV的特异性和敏感性检测。附图说明图1为PCV2基因部分保守序列分析结果。图2为PRV/猪猪孢疹病毒基因部分保守序列分析结果。图3为PRRSV基因部分保守序列分析结果。图4为PCV2扩增序列比对结果。图5为PRV扩增序列比对结果。图6为PRRSV扩增序列比对结果。图7为PCV2、PRV、PRRSV三重PCR检测方法的最佳酶浓度，M代表DNAMarkerDL1000，第1-7泳道分别代表Taq酶的添加量为0.3μL-0.9μL时的PCR扩增结果。图8为PCV2、PRV、PRRSV三重PCR检测方法的最佳引物浓度，M代表DNAMarkerDL1000，第1-7泳道分别代表引物的添加量为0.5μL-1.1μL时的PCR扩增结果。图9为PCV2、PRV、PRRSV三重PCR检测方法的最佳退火温度，M代表DNAMarkerDL1000，第1-7泳道分别代表退火温度为50.0℃-55.0℃时的PCR扩增结果。图10为PCV2、PRV、PRRSV三重PCR检测方法的最佳循环次数，M代表DNAMarkerDL1000，第1-7泳道分别代表循环次数为23次-35次时的PCR扩增结果。图11为PCV2、PRV、PRRSV三重PCR检测方法的特异性试验结果，M代表DNAMarkerDL1000，第1-7泳道分别为以PCV2、PRV的DNA和PRRSV的cDNA的混合核酸；PCV2的DNA；PRV的DNA；PRRSV的cDNA；PEDV的cDNA；CSFV的cDNA及ddH2O为模板的扩增结果。图12为PCV2、PRV、PRRSV三重PCR检测方法的敏感性试验结果，M代表DNAMarkerDL1000，第1-6泳道分别为10-1～10-6倍稀释的PCV2、PRV的DNA和PRRSV的cDNA的混合核酸扩增结果；第7泳道是以ddH2O为模板的扩增结果。具体实施方式1、本专利技术所涉及的实验材料及组分记载如下：1.1毒株及临床样品PCV2、PRV、PRRSV疫苗均购自瑞普生物技术股份有限公司；79份猪圆环病、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸障碍综合征的疑似病料采集自2016年6月至2016年12月山东境内13个猪场的患病猪只。1.2试验试剂DNAzolReagent、RNAisoPlus、premixTaq(ExTaqVersionn2.0plusdug)、dNTPs、ExTaq、RecombinantRAaseInhibitor、5×ReverTranscriptaseM/MLVBuffer、ReverTransciptaseM-MLV、dNTP、DNAMarker(DL1000)购自TaKaRa公司；DEPC购自Sigma公司；无水乙醇、氯仿、异丙醇购自上海国药。1.3试验仪器台式高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；超净工作台：苏州净化设备有限公司；PCR扩增仪：AppliedBiosystems9700，AppliedBiosystems；电热恒温水浴锅：龙口市先科仪器有限公司；微量振荡器：金坛市恒丰仪器厂；紫外可见分光光度计：日本岛津；全温振荡器：中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；电子天平：上海海康电子仪器厂；紫外凝胶成像系统：T2A，BIO-RAD。2、本专利技术所所涉及的方法步骤记载如下：2.1病料的处理取病猪的淋巴结、扁桃体、脾脏等病变实质器官，剪取5～10g，置于灭菌的小烧杯中剪碎，加入约4倍体积的灭菌PBS，然后将组织混合物转移到研钵中研磨至糊状，反复冻融3次，12000rpm离心10min，取上清保存于-80℃冰箱。2.2病毒DNA的提取(1)在离心管加入250μL组织匀浆和750μLDNAzol，使其充分混匀后，在室温条件下孵育5min，12000rpm4℃离心10min。(2)取500μL上清放入新的1.5mL离心管中，然后在离心管中加入-20℃预冷的无水乙醇500μL，充分混匀后，在室温条件下孵育5min。(3)12000rpm4℃离心10min。(4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR引物组，其特征在于，所述的引物组中包含有：检测PCV2的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:1；下游引物的序列为SEQ ID NO:2；检测PRV的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:3；下游引物的序列为SEQ ID NO:4；检测PRRSV的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO:5；下游引物的序列为SEQ ID NO:6。

【技术特征摘要】
1.一种检测PCV2、PRV、PRRSV的多重PCR引物组，其特征在于，所述的引物组中包含有：检测PCV2的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:1；下游引物的序列为SEQIDNO:2；检测PRV的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:3；下游引物的序列为SEQIDNO:4；检测PRRSV的引物对，其上游引物的序列为SEQIDNO:5；下游引物的序列为SEQIDNO:6。2.权利要求1所述的引物组在制备检测PCV2、PRV、PRRSV的制品中的应用。3.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：单虎，解倩倩，杨瑞梅，单一恒，秦志华，张洪亮，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37