鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记、引物及该引物用途制造技术

本发明专利技术涉及一种鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记、引物及该引物用途。标记包括用于检测野生型位点的标记Cas‑Osrr22‑1，所述标记Cas‑Osrr22‑1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，还包括用于检测突变体WDR58‑cas‑1位点的标记Cas‑Osrr22‑2，所述标记Cas‑Osrr22‑2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术中的标记、引物及该引物用途较现有水稻育种技术具有用于区分WDR58‑cas‑1突变体与野生型的分子标记，以实现耐盐基因Osrr22突变体基因型的高效鉴定，在后续利用WDR58‑cas‑1突变体进行耐盐育种中具有重要价值。应用于水稻耐盐性状改良的辅助育种，可以在杂交育种、回交分离群体等进行鉴定，准确的区分杂合和纯和基因型，提高育种效率等。

Identification of specific CAPS markers, primers and primers for identification of rice salt tolerant gene OsRR22 wild type or mutant

The invention relates to a specific CAPS marker, primer and use of the primer for identifying wild type or mutant of salt tolerance gene OsRR22 in rice. The marker includes the marker Cas Osrr22 1 for detecting the wild-type loci, and the nucleotide sequence of the labeled Cas Osrr22 1, as shown by the SEQ ID NO:2, also includes a marker Cas Osrr22 Osrr22 2 for detecting the mutant WDR58 CAS 1 loci. The markers, primers and the use of the primer are used to distinguish the molecular markers of WDR58 CAS 1 mutant and wild type in comparison with the existing rice breeding techniques, so as to realize the efficient identification of the salt tolerant gene Osrr22 mutant genotype. It is of great value in the subsequent use of the WDR58 CAS 1 mutant for salt tolerance breeding. The auxiliary breeding, which is applied to the improvement of salt tolerance in rice, can be identified in hybrid breeding and backcross separation groups. It can accurately distinguish heterozygosity, purity and genotype, and improve breeding efficiency.

【技术实现步骤摘要】
鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记、引物及该引物用途
本专利技术涉及植物生物
，具体涉及一种能够用于鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记、引物及该引物用途。
技术介绍
水稻(OryzasativaL．)是世界上最重要的粮食作物之一，是全球三分之一人口的主要口粮，水稻产量是否供给充足直接影响全球粮食安全。而盐碱胁迫是制约水稻生产的主要非生物胁迫因素之一。关于盐碱胁迫，一方面，还有较大面积的盐碱地无法种植水稻，另一方面，我们面临的环境日益恶化，土地盐碱化逐年加剧，全球受盐侵害的稻田约占栽培面积的20%，提高水稻耐盐性已成为育种家的重要目标之一。截至目前，已经克隆的耐盐相关的基因有：SKC1,DST,OsRR22,HAL2,P5CS,CMO,BADH,mtlD,gutD和SAMDC等。其中，OsRR22是一个负调控基因，编码一个696个氨基酸的B型反应调节蛋白转录因子，参与细胞分裂素信号转导和代谢，它的功能缺失显著提高了耐盐性。CRISPR/Cas是一种在细菌和古细菌中发现的获得性免疫防御系统，目前已发现的CRISPR/Cas系统包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中Ⅱ型系统的组成较简单，由其改造成的CRISPR/Cas9技术以其易操作、低成本、高效率、高特异性和多重基因编辑等优势迅速成为了植物基因组精确编辑最为有效的工具，广泛地应用于动物、植物、微生物等基因功能和遗传改良研究。利用CRISPR/Cas9技术定点敲除不利基因或者负调控基因，快速敲除控制不良性状的基因簇从而实现目标性状的精准改良，将会大大提高作物定向遗传改良效率。CAPs(cleavedamplificationpolymorphismsequence-taggedsites)技术又可称为PCR-RFLP，限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术。所用的PCR引物是针对特定的位点而设计的。其基本步骤是：先进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切，再用琼脂糖凝胶电泳检测观察多态性。申请人日前增对自选育粳稻品种WDR58（其为秀水123///秀水123//秀水123/75-1-127，即将75-1-127与秀水123杂交，再将其后代与秀水123回交两次再自交5代所得的稳定品系），通过CRISPR/Cas9技术定点编辑水稻耐盐基因OsRR22，获得一个耐盐性显著提高的Osrr22基因功能缺失纯和突变体WDR58-cas-1。为提高WDR58-cas-1突变体在耐盐育种中的利用效率，如何开发一种用于区分WDR58-cas-1突变体与野生型的分子标记，以实现耐盐基因Osrr22突变体基因型的高效鉴定，在后续利用WDR58-cas-1突变体进行耐盐育种中具有重要价值。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提出一种用于鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记、引物及该引物用途。本专利技术为解决上述技术问题提出的技术方案（一）是：一种鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记，其特征在于：包括用于检测野生型位点的标记Cas-Osrr22-1，所述标记Cas-Osrr22-1的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。2、根据权利要求1所述的鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记，其特征在于：所述突变体为WDR58-cas-1，所述标记还包括用于检测突变体WDR58-cas-1位点的标记Cas-Osrr22-2，所述标记Cas-Osrr22-2的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术为解决上述技术问题提出的技术方案（二）是：一种用于鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记的引物，其特征在于所述的引物为：上游引物CAPS-TailⅠF：5’-CTTGGGATTGCTCTGTTTCT-3’下游引物CAPS-TailⅠR：5’-GTAATAGCCTGGTTGGTTGAT-3’。本专利技术为解决上述技术问题提出的技术方案（三）是：上述用于鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记的引物在水稻耐盐辅助育种中的应用。进一步的，前述应用包含以下步骤：i、提取供试水稻样品基因组DNA；ii、利用所述引物CAPS-TailⅠ-F和CAPS-TailⅠ-R对步骤i中得到DNA进行PCR扩增；iii、将步骤ii中得到的扩增产物经过限制性内切酶TailⅠ酶切，并对酶切产物进行分析，如果所述扩增产物能够切成255bp和400bp的特征条带，所述样品为Osrr22基因突变纯合体；如果所述扩增产物不能酶切，只含有654bp的特征条带，所述样品为野生型；如果所述酶切产物同时存在654bp、255bp和400bp的特征条带，则所述样品为Osrr22基因突变杂合体。进一步的，在步骤ii中，所述PCR扩增的扩增体系为：20ng水稻基因组DNA模板，10uLTaqPCRMastermix，10uM的前后引物各1uL，补充ddH2O至20uL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min，然后按95℃30s，55℃下30s，72℃下45s进行30个循环，最后72℃下延伸5min；在步骤iii中，所述酶切的反应体系为：2uL10×FastDigestBuffer，1uLFastDigestTailⅠ，10uLPCR产物，补充ddH2O至30uL，反应条件65℃反应5min；之后进行琼脂糖凝胶电泳检测。本专利技术的有益效果是：本专利技术中的标记、引物及该引物用途较现有水稻育种技术具有以下优点：1、开发了一种用于区分WDR58-cas-1突变体与野生型的分子标记，以实现耐盐基因Osrr22突变体基因型的高效鉴定，在后续利用WDR58-cas-1突变体进行耐盐育种中具有重要价值。2、本专利技术提供的CAPS标记是根据耐盐基因OsRR22在突变体和野生型之间CRISPR/Cas9特异修饰的位点设计的基于PCR扩增和限制性内切酶的功能性标记，其基因型能直接反映植株的表型，不存在由于遗传交换而造成的误差，操作上较测序方法简捷，降低了成本。3、本专利技术提供的分子标记方法应用于水稻耐盐性状改良的辅助育种，可以在杂交育种、回交分离群体等进行鉴定，准确的区分杂合和纯和基因型，提高育种效率。附图说明图1是是OsRR22基因靶点序列示意图；图2是鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型和突变体的特异性CAPS标记及其引物设计策略；图3是CAPS-TailⅠPCR扩增产物经酶切后在1.5%的琼脂糖凝胶电泳结果。图2中，箭头表示上下游引物所在位置，黑框部分表示单碱基插入产生的TailⅠ的酶切位点。具体实施方式pYLgRNA-OsU6a/LacZ质粒和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体均由华南农业大学生命科学学院提供（Maetal.,2015,MolecularPlant,DOI:10.1016/j.molp.2015.04.007）；水稻品系为WDR58，其为秀水123///秀水123//秀水123/75-1-127，即将75-1-127与秀水123杂交，再将其后代与秀水123回交两次再自交5代所得的稳定品系。实施例1：本实施例涉及基于CRISPR-Cas9技术的水稻耐盐基因Osrr22本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记，其特征在于：包括用于检测野生型位点的标记Cas‑Osrr22‑1，所述标记Cas‑Osrr22‑1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记，其特征在于：包括用于检测野生型位点的标记Cas-Osrr22-1，所述标记Cas-Osrr22-1的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。2.根据权利要求1所述的鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记，其特征在于：所述突变体为WDR58-cas-1，所述标记还包括用于检测突变体WDR58-cas-1位点的标记Cas-Osrr22-2，所述标记Cas-Osrr22-2的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。3.一种用于鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记的引物，其特征在于所述的引物为：上游引物CAPS-TailⅠF：5’-CTTGGGATTGCTCTGTTTCT-3’下游引物CAPS-TailⅠR：5’-GTAATAGCCTGGTTGGTTGAT-3’。4.权利要求3所述的用于鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记的引物在水稻耐盐辅助育种中的应用。5.根据权利要求4所述的用于鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记的引物在水稻耐盐辅助育种中的应用，其特征在于包含以下步骤：i、提取供试水稻样品基因组DNA；ii、利用所述引物CAP...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘毅，刘国兰，张安宁，唐金娟，李天菲，孔德艳，余新桥，罗利军，
申请(专利权)人：上海市农业生物基因中心，
类型：发明
国别省市：上海,31