鸡环RNAChr26:2670958|2679178的检测引物、方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种鸡环RNA Chr26:2670958|2679178的检测引物、方法及应用。该引物包括鸡环RNA Chr26:2670958|2679178环状上游引物和鸡环RNA Chr26:2670958|2679178环状下游引物；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。利用本发明专利技术所提供的方法，可以准确检测鸡感染肠炎沙门氏菌后鸡环RNA Chr26:2670958|2679178相对表达情况，以此作为分子标记鉴定沙门氏菌感染抗性个体，为鸡抗肠炎沙门氏菌感染的遗传育种提供理论基础和科学依据。

Detection primers, methods and applications of chicken ring RNAChr26:2670958|2679178

The invention discloses a detection primer, a method and an application of chicken ring RNA Chr26:2670958|2679178. The primers included the RNA upstream primers of the chicken ring Chr26:2670958|2679178 and the ring downstream primers of the chicken ring RNA Chr26:2670958|2679178, and the nucleotide sequences, such as SEQ ID NO.1 and SEQ ID ID NO.2, were shown respectively. By using this method, the relative expression of RNA Chr26:2670958|2679178 in chickens infected with Salmonella enteritis can be accurately detected as a molecular marker to identify the infected individuals of Salmonella and provide a theoretical basis and scientific basis for the genetic breeding of the infection of Salmonella enteritis.

【技术实现步骤摘要】
鸡环RNAChr26:2670958|2679178的检测引物、方法及应用
本专利技术属于基因工程
，具体地说，涉及一种鸡环RNAChr26:2670958|2679178的检测引物、方法及应用。
技术介绍
肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis，SE)是常见的人畜共患病原菌，因其无宿主特异性，因此不仅能够引起家禽急性胃肠炎等疾病甚至发病致死，给养禽业造成巨大经济损失，而且严重危害人类健康，造成食物中毒，是影响人身心健康的重要病原菌之一。有关报道指出，2004年期间，在美国每1百万人中有19000人因感染沙门氏菌而住院，多达300人因沙门氏菌感染出现死亡；在欧盟，2010年间约有99020起因沙门氏菌感染引起的食源性疾病爆发。家禽及其相关加工产品是肠炎沙门氏菌的主要传染源，盲肠是其主要宿主，肠炎沙门氏菌能够透过蛋壳进入鸡蛋产品中，且能在生殖道中寄存繁殖。目前控制沙门氏菌感染的主要方法是使用疫苗和抗生素，但这不能从根本上解决问题，而且抗生素的大量使用会引起食品安全问题及细菌的耐药性，且造成菌株耐药性增强。随着分子遗传学的发展，提高畜禽对疾病和病原的遗传抗性，为控制沙门氏菌的感染提供新的可能性。环RNA是一种新型的非编码RNA。环RNA呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。不含有5’-3’极性。但是环RNA在动物中具有组织特异性的广泛丰富的表达。在功能上，近年的研究表明，环RNA分子富含microRNA(miRNA)结合位点，在细胞中起到miRNA海绵(miRNAsponge)的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高来源基因的表达水平；这一作用机制被称为竞争性内源RNA(ceRNA)机制。通过与疾病关联的miRNA相互作用，环RNA在疾病中发挥着重要的调控作用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种鸡环RNAChr26:2670958|2679178的检测引物、方法及应用。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种鸡环RNAChr26:2670958|2679178的检测引物，包括鸡环RNAChr26:2670958|2679178环状上游引物和鸡环RNAChr26:2670958|2679178环状下游引物，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。本专利技术还公开了一种鸡环RNAChr26:2670958|2679178的检测方法，包括以下步骤：步骤1、待测样本RNA的提取；步骤2、进行反转录得到cDNA；步骤3、用权利要求1中所述的引物，对待测样本cDNA进行定量PCR扩增，得到PCR扩增产物；步骤4、采用2-△△CT方法计算基因相对表达量，具体计算公式如下：△CT＝CT目的基因-CTGAPDH，△△CT＝△CT目的基因-△CT参照基因；其中，△CT代表所需验证基因的CT值减去内参基因的CT值；CT目的基因代表所需验证基因的CT值；CTGAPDH代表内参基因的CT值；△△CT代表目的基因的△CT值减对照组目的基因△CT的平均值；△CT目的基因代表目的基因的△CT值；△CT参照基因代表对照组目的基因△CT的平均值；步骤5、根据PCR扩增产物及基因相对表达量判断待测样本是否含有环RNAChr9:10814512|10838667基因及其表达情况。进一步地，所述步骤1中的待测样本RNA的提取具体为：采用Trizol法提取样品总RNA，抽提所得总RNA经安捷伦生物分析仪2100和Qubit2.0进行质检。进一步地，所述步骤2中的待测样本cDNA的提取具体按照以下步骤实施：选择肠炎沙门氏菌阴性个体，通过口服方法接种肠炎沙门氏菌，接种量为107-109cfu/只，接种后第7天，取盲肠内容物，利用平板计数法测定细菌含量。采取盲肠组织样，提取RNA，并用RNaseR对提取的RNA进行处理，消化掉线性RNA，进行反转录生成cDNA。进一步地，所述步骤3中的定量PCR反应体系如下：2xSYBRPremixExTaqTM10μL，10μM鸡环RNAChr26:2670958|2679178环状上游引物0.5μL，10μM鸡环RNAChr26:2670958|2679178环状下游引物0.5μL，待测样本cDNA2.0μL，dH2O7μL，以上总体积为20μL。进一步地，所述步骤3中的定量PCR扩增条件为：95℃，30s；95℃，5s，59℃，30s，40个循环；95℃，1min；61℃，30s；95℃，30s，1个循环。本专利技术还公开了一种上述的鸡环RNAChr26:2670958|2679178的检测引物在检测鸡抗肠炎沙门氏菌感染中的应用。本专利技术还公开了一种上述的鸡环RNAChr26:2670958|2679178的检测方法在检测鸡抗肠炎沙门氏菌感染中的应用。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：利用本专利技术所提供的方法，可以准确检测鸡感染肠炎沙门氏菌后鸡环RNAChr26:2670958|2679178相对表达情况，以此作为分子标记鉴定沙门氏菌感染抗性个体，为鸡抗肠炎沙门氏菌感染的遗传育种提供理论依据。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术PCR产物电泳图；其中，M:DL2000marker，1:基因组DNA引物为环状引物；2，3：cDNA引物为环状引物；4，5：cDNA引物为线性引物；6代表基因组DNA引物为环状引物，7，8代表cDNA引物为环状引物，9，10代表cDNA引物为线性引物；图2是本专利技术鸡环RNAChr26:2670958|2679178的相对定量表达。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1RNAChr26:2670958|2679178的检测方法的建立选择肠炎沙门氏菌阴性个体，通过口服方法接种肠炎沙门氏菌，接种量为107-109cfu/只，接种后第7天，取盲肠内容物，利用平板计数法测定细菌含量。采取盲肠组织样，提取RNA，并用RNaseR对提取的RNA进行处理，消化掉线性RNA，进行反转录生成cDNA。根据鸡环RNAChr26:2670958|2679178基因序列，设计特异性环状和线性引物(表1和表2)，进行扩增。人工序列(Artificialsequence)表1：鸡环RNAChr26:2670958|2679178环状引物序列表2：鸡环RNAChr26:2670958|2679178线性引物序列利用上述特异性定量环状引物进行定量PCR扩增，其PCR扩增反应体系如下表3。表3：定量PCR反应体系(20μL)定量PCR扩增条件为：95℃，30s；40个循环(95℃，5s，59℃，30s)；1个循环(95℃，1min；61℃，30s；95℃，30s)。利用上述线性引物进行普通PCR扩增，其PCR扩增反应体系如下表4。表4：PCR扩增反应体系普通PCR扩增条件为：30个循环(98℃，10s，55℃，30s，72本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡环RNA Chr26:2670958|2679178的检测引物，其特征在于，包括鸡环RNA Chr26:2670958|2679178环状上游引物和鸡环RNA Chr26:2670958|2679178环状下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种鸡环RNAChr26:2670958|2679178的检测引物，其特征在于，包括鸡环RNAChr26:2670958|2679178环状上游引物和鸡环RNAChr26:2670958|2679178环状下游引物，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。2.一种鸡环RNAChr26:2670958|2679178的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、待测样本RNA的提取；步骤2、进行反转录得到cDNA；步骤3、用权利要求1中所述的引物，对待测样本cDNA进行定量PCR扩增，得到PCR扩增产物；步骤4、采用方法计算基因相对表达量，具体计算公式如下：△CT＝CT目的基因-CTGAPDH，△△CT＝△CT目的基因-△CT参照基因；其中，△CT代表所需验证基因的CT值减去内参基因的CT值；CT目的基因代表所需验证基因的CT值；CTGAPDH代表内参基因的CT值；△△CT代表目的基因的△CT值减对照组目的基因△CT的平均值；△CT目的基因代表目的基因的△CT值；△CT参照基因代表对照组目的基因△CT的平均值；步骤5、根据PCR扩增产物及基因相对表达量判断待测样本是否含有环RNAChr9:10814512|10838667基因及其表达情况。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1中的待测样本RNA的提取具体为：采用Trizol法提取样品总RNA，抽提所得总RNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：李显耀，郑林娜，刘丽英，王园美，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37