一种类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增引物组、核酸试纸条试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增引物组、核酸试纸条试剂盒及其检测方法。所述检测方法，包括步骤：(1)样品处理；(2)引物处理；(3)环介导等温扩增反应；(4)核酸试纸条检测。所述引物组是根据编码类志贺邻单胞菌亚铁血红素铁离子利用系统的重要基因之一hugA基因序列，设计出的一对内引物、一对外引物和一对环引物，能够特异性识别靶序列上的8个独立区域。所述试剂盒可快速、灵敏地检测类志贺邻单胞菌，无需昂贵仪器，只需一个恒温水浴锅一小时内即可完成反应，操作简单、成本低廉，反应结果易与观察，特异性好，非常适用于出口检疫、基层实验室以及养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。

A loop mediated isothermal amplification primer set, nucleic acid strip test kit and its detection method for a class of isolates of A. Shigella

The invention discloses a ring mediated isothermal amplification primer group, a nucleic acid test strip kit and a detection method thereof. The detection method comprises the following steps: (1) sample processing; (2) primer processing; (3) loop mediated isothermal amplification reaction; (4) nucleic acid test strip detection. The primer group is based on the sequence of hugA gene, one of the important genes of the heme iron ion utilization system of ortho Shigella, which is designed by a pair of primers, a primer and a pair of ring primers, which can specifically identify 8 independent regions on the target sequence. The kit can quickly and sensitively detect Shigella like monomonas spp., without expensive instruments, only one constant temperature water bath can be used in one hour to complete the reaction. It is easy to operate, low cost, easy to observe and have good specificity. It is very suitable for field inspection of export and quarantine, basic laboratory and breeding farm. It is easy to extend and apply in large scope.

【技术实现步骤摘要】
一种类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增引物组、核酸试纸条试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及生物

技术介绍
类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)是一种革兰氏阴性、需氧或兼性厌氧、氧化酶阳性的运动性杆菌，曾与对人类致病的弧菌属和气单胞菌属一起归属于弧菌科，后研究发现其在分子水平跟类志贺邻单胞菌和变形杆菌属更为接近，在第二版《系统细菌学伯杰氏手册》中，类志贺邻单胞菌划归到肠杆菌科，邻单胞菌属。类志贺邻单胞菌是人类重要的肠炎性病原，可引发人类急性肠胃炎、腹泻等症状，同时也可以引起败血症、脑膜炎、化脓性关节炎、骨髓炎、腹膜炎、蜂窝组织炎和肺炎等肠外感染症状。类志贺邻单胞菌广泛分布于自然界中，尤其在水生态环境和动物体内更为常见，是一种世界性分布的细菌，可引起多种疾病的发生。近年来的研究发现，类志贺邻单胞菌该菌可感染赤麻鸭、犬，引起肠道疾病，导致死亡；也可单独或与其他细菌共同感染亚洲龙鱼、革胡子鲇、水貂、中华绒螯蟹、中华鳖、暗纹东方魨、罗氏沼虾、鲟鱼、墨头鱼、鳗鲡、异育银鲫、斑点叉尾鮰、虹鳟、黄颡鱼、草鱼和黄沙鳖幼鳖等多种水生动物。这些研究表明，类志贺邻单胞菌是一种人-兽-鱼共患病原菌。目前类志贺邻单胞菌的检测方法主要有微生物培养法、生化鉴定，普通PCR和实时荧光PCR等分子生物学方法。微生物培养法耗时且培养条件复杂；生理生化鉴定结果的判读依赖于操作者的主观判断，从而导致结果重复差，易错判；分子检测如PCR、实时荧光PCR技术需要昂贵的仪器设备、技术要求高。由于各自的缺陷，常规的病原检测技术大都不适合养殖基层的现场快速检测。2000年日本的科学家Notomi等人专利技术了一种新的核酸扩增技术环介导等温扩增技术(Loop-MediatedIsothermalAmplification，LAMP)，LAMP的特征是针对目标DNA链上的6个区段设计4条不同的引物(FIP,BIP,F3,B3)，在链置换BstDNA聚合酶的作用下于恒温60℃-65℃扩增60min左右，即可进行循环扩增，且效率可达109-1010个数量级。LAMP反应具有较高的专一性，只有4条引物在靶基因中的6个不同区域完全匹配才能进行扩增。LAMP反应产物的检测手段多种多样，有琼脂糖凝胶电泳检测、限制性酶切鉴定、白色沉淀肉眼观察法、实时浊度定量检测、钙黄绿素做荧光指示、SYBRGreenI染色观察方法和核酸试纸条检测等。
技术实现思路
本专利技术提供了一种类志贺邻单胞菌的特异性引物组，能够特异性识别hugA基因上的8个独立区域。类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增引物组，包括引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB，各引物的序列如表1所示。表1实验中所用到的LAMP引物序列本专利技术还提供了一种能够快速、准确地检测类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增核酸试纸条试剂盒，包括上述环介导等温扩增引物组、核酸试纸条检测装置和反应液，所述反应液包括Bst2.0WarmStartDNA聚合酶，10×buffer，dNTPMix，MgSO4，甜菜碱(betaine)和双蒸水。其中，所述引物FIP的5’端标记有异硫氰酸荧光素(FITC)或6-羧基荧光素(6-FAM)。所述引物BIP的5’端标记有生物素(Biotin)。进一步，引物组中各引物的引物浓度均为10μM。进一步，所述引物F3和引物B3的总体积为0.5ul；引物FIP和引物BIP的总体积为5ul；引物LF和引物LB的总体积为2ul。所述引物组的总体积为7.5ul。进一步，所述反应液包括10×buffer2.5μl，MgSO4(100mmol/L)1.5μl，dNTP(10mmol/L)3.5μl，BstDNA聚合酶(8U/μl)1μl，甜菜碱(betaine)2.5μl，余量为双蒸水。该类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增核酸试纸条试剂盒的检测方法，包括以下步骤：(1)样品处理：从待检鱼类的组织器官分离细菌，作为样品；(2)引物处理：将引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB混合，得到引物试剂；(3)环介导等温扩增反应：将样品、引物试剂和反应液混合均匀后，放入恒温水浴锅，在64℃下，进行环介导等温扩增反应40分钟；(4)核酸试纸条检测：将环介导等温扩增反应后的产物用核酸检测试纸条检测，10mim观察结果。本专利技术的有益效果包括：所述引物组是根据编码类志贺邻单胞菌亚铁血红素铁离子利用系统的重要基因之一hugA基因(GeneBankID号：AY008342.1)序列，设计出的一对内引物(引物F3和引物B3)、一对外引物(引物FIP和引物BIP)和一对环引物(引物LF和引物LB)，能够特异性识别靶序列上的8个独立区域。所述的检测类志贺邻单胞菌的LAMP核酸试纸条试剂盒可快速、灵敏地检测类志贺邻单胞菌，无需昂贵仪器，只需一个恒温水浴锅一小时内即可完成反应，操作简单、成本低廉，反应结果易与观察，特异性好，非常适用于出口检疫、基层实验室以及养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。附图说明图1是实施例2所述类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增核酸试纸条试剂盒特异性实验a1～a9样的检测结果图；图2是实施例2所述类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增核酸试纸条试剂盒特异性实验a10～a17样的检测结果图；图3是实施例3所述类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增核酸试纸条试剂盒敏感性实验b1～b11样的检测结果图；图4是实施例4所述类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增核酸试纸条试剂盒对18份菌株样本中的c1～c10样的检测结果图；图5是实施例4所述类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增核酸试纸条试剂盒对18份菌株样本中的c11～c20样的检测结果图。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1：类志贺邻单胞菌的LAMP反应。LAMP的反应体系为25μl：0.2ml的PCR反应管中加入菌液模板2μl，10×buffer2.5μl，MgSO4(100mmol/L)1.5μl，0.5ul的引物F3和B3、5ul的引物FIP和BIP、2ul的引物LF和LB，dNTP(10mmol/L)3.5μl，BstDNA聚合酶(8U/μl)1μl，甜菜碱(betaine)2.5μl，ddH2O补齐至25μl。使用64℃扩增40min。LAMP扩增后的产物，用核酸试纸条检测。所使用的核酸试纸条检测装置购自杭州优思达生物技术有限公司。实施例2：类志贺邻单胞菌的LAMP核酸试纸条检测试剂盒特异性实验。试验用菌株：鱼源致病性类志贺邻单胞菌，编号为a1；维氏气单胞菌，编号为a2；温和气单胞菌，编号为a3；嗜水气单胞菌，编号为a4；豚鼠气单胞菌，编号为a5；费氏柠檬酸杆菌，编号为a6；柱状黄杆菌，编号为a7；恶臭假单胞菌，编号为a8；铜绿假单胞菌，编号为a9；肺炎克雷伯菌，编号为a10；迟钝爱德华菌，编号本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增引物组，包括引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB，各引物的序列如SEQ ID №1～6所示。

【技术特征摘要】
1.一种类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增引物组，包括引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物LF和引物LB，各引物的序列如SEQID№1～6所示。2.一种类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增核酸试纸条试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组和核酸试纸条检测装置。3.根据权利要求2所述的类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增核酸试纸条试剂盒，其特征在于，还包括反应液，所述反应液包括Bst2.0WarmStartDNA聚合酶，10×buffer，dNTPMix，MgSO4，甜菜碱和双蒸水。4.根据权利要求3所述的类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增核酸试纸条试剂盒，其特征在于，所述引物组中的引物FIP的5’端标记有异硫氰酸荧光素或6-羧基荧光素。5.根据权利要求3所述的类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增核酸试纸条试剂盒，其特征在于，所述引物组中的引物BIP的5’端标记有生物素。6.根据权利要求1～5任一项所述的类志贺邻单胞菌的环介导等温扩增核酸试纸条试剂盒，其特征在于，引物组中各引物的引物浓度均为10μM。7.根据权利要求6所述的类志贺邻单胞菌的...

【专利技术属性】
技术研发人员：于辉，彭钟琴，刘华，杨映，李东琦，谭淑雯，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：广东,44