一种快速鉴别新疆和黑龙江江鳕的分子生物学方法技术

本发明专利技术公开了一种快速鉴别新疆和黑龙江江鳕的分子生物学方法，其具体技术方案为：对采自于新疆和黑龙江江鳕提取基因组DNA；利用PCR反应扩增两个种群江鳕线粒体DNA的tRNA

A molecular biological method for rapid identification of Xinjiang and Heilongjiang waters

The invention discloses a molecular biological method for rapid identification of Xinjiang and Heilongjiang River haddock. The specific technical scheme is to extract genomic DNA from Xinjiang and Heilongjiang haddock, and to amplify the tRNA of two populations of the mitochondrial DNA of the Haddock by PCR reaction.

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴别新疆和黑龙江江鳕的分子生物学方法
本专利技术属于分子生物
，尤其是涉及一种快速鉴别新疆和黑龙江江鳕的分子生物学方法。
技术介绍
江鳕（LotalotaLinnaeus，1758）隶属鳕形目Gadiformes、鳕亚目Gadoidae、鳕科Gadidae、江鳕属Lota，俗称山鳕、山鲶鱼、山怀子。属北极淡水区系类群的冷水性鱼类，也是鳕科鱼中唯一的淡水种类。地理起源于原亚洲和欧洲北部北冰洋地区的寒原带（苔原带）。目前主要分布于45°N以北的欧洲、亚洲和北美洲的内陆水域，在我国主要分布于黑龙江、鸭绿江、乌苏里江、松花江和新疆额尔齐斯河水系。不同地理分布区内，江鳕群体的形态特征存在很大差异，一直以来作为区别亚种的依据。已有研究证实，我国额尔齐斯河流域江鳕为江鳕的指名亚种（L.lotalota），然而黑龙江水系江鳕的分类地位仍一直存在争议。近年来随着生物技术的发展，研究人员从同工酶和线粒体DNA基因组的角度对比分析，认为黑龙江江鳕是与已发现的北美系统发育类群和欧亚-白令海系统发育类群不同的一个新类群，也就是说黑龙江江鳕很可能是独立于江鳕指名亚种（L.lotalota）和北美斑江鳕亚种（L.lotamaculosa）之外的一个新的亚种。作为重要的冷水性经济鱼类，江鳕肉质细嫩、味道鲜美，尤其肝脏十分肥大（约占体重的6-9%），食用口感极佳。此外，江鳕也是制造鱼肝油唯一的淡水鳕科鱼类，具有较高的经济、药用价值和重要科学研究价值。一方面江鳕的自然产量较低，另一方面市场消费需求较大，导致近年来天然水域江鳕资源数量急剧下降，黑龙江省政府已将其列入地方重点保护野生动物名录，新疆额尔齐斯河流域江鳕种群也难以形成捕捞产量。为了保护江鳕这一重要冷水性鱼类资源，国内部分科研机构和水产养殖企业相继开展了江鳕人工繁殖工作，取得了一定成绩。为了避免养殖过程中江鳕亲本来源不明问题，防止出现种质混杂。本专利技术提供了一种方便、准确的鉴别新疆和黑龙江江鳕的分子生物学方法，为江鳕种质保护和合理开发利用等相关领域研究提供技术支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种方法简单、快捷、准确的快速鉴别新疆和黑龙江江鳕的分子生物学方法，结合电泳模式图和序列比对结果，从基因特征上区别新疆和黑龙江江鳕亚种，为该亚种的鉴定提供可靠依据。本专利技术针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种快速鉴别新疆和黑龙江江鳕的分子生物学方法，其具体技术方案为：步骤1：对采自于新疆额尔齐斯河水系布尔津河和黑龙江水系多布库尔河的江鳕提取基因组DNA；步骤2：利用PCR反应扩增两个地理种群江鳕线粒体DNA的tRNAThr和tRNAPro之间的一段非编码区序列；步骤3：对PCR扩增产物进行电泳分离、染色，构建江鳕DNA电泳模式图；步骤4：采用一代测序技术对该非编码区进行序列测定；步骤5：结合电泳模式图和序列比对结果，鉴定两个种群江鳕。作为优选，PCR反应引物序列为：PF：5′-AGCATCCGTCCTGTACTTCT-3′；PR：5′-CATTAGGGGAACGTAAGTGG-3′。上述引物长度适当，与模板的序列紧密互补，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低，其自身不存在互补序列，自身难以形成发夹结构，与模板的序列能够紧密互补，且延伸温度小于74℃，上、下游引物的GC含量合适，有利于扩增反应的进行，增加PCR产物的量。作为优选，PCR反应总体系为：12.5μL2×EasyTaq®PCRSuperMix(+dye)，10μM的引物各1μL，江鳕基因组DNA0.5-1μg，加灭菌水至终体积25μL。作为优选，PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后是30个循环，每个循环包括94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min。该步骤操作合理，能够保证引物同PCR产物有效退火，同时可减少二聚体和非特异性产物的形成，提高PCR产物的稳定和可靠性。作为优选，电泳分离步骤为：将电泳缓冲液加入电泳槽中，直至没过琼脂糖凝胶面0.5cm，直接将4μLPCR产物依次加入点样孔，并点上6μLD2000DNAMarker（片段大小为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp），接通电泳槽和电泳仪的电源后开始电泳，电泳电压设定为80V，电泳时间60min，电泳完毕通过凝胶成像系统照相，调节光圈和曝光时间，选择合适的滤光片，得到成像清晰、背景较低的照片，单一、明显的条带为合格产物，用回收试剂盒回收后对该PCR产物进行序列测定。作为优选，电泳用琼脂糖凝胶为浓度2%的琼脂糖凝胶，其制备方法为：称量1g琼脂糖加入50mL1×TAE缓冲液的锥形瓶中，微波炉加热煮沸，使琼脂粉完全溶解，待凝胶液凉至50-60℃，加入7μL核酸染料Gelview，轻轻摇匀后将胶缓缓倒入胶槽内，此过程中应避免产生气泡，待琼脂糖凝胶完全凝固后竖直拔掉梳子，清除碎胶并将胶槽放入电泳槽内。作为优选，PCR产物直接送生物公司采用Sanger法进行正反测序，该测序方法能够保证序列的准确性。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术分子生物学方法结合电泳模式图和序列比对结果，从基因特征上区鉴别新疆和黑龙江江鳕（Lotalota）种群，为该物种的鉴定提供可靠依据；该分子生物学方法具有简单、快捷、准确的特点，相比传统的形态特征鉴定方法，既可节省时间又可减少费用；鉴别方法对使用的仪器设备要求较低，比传统的形态学鉴别更准确可靠；鉴别方法从根本上证明了黑龙江江鳕是与已发现的北美系统发育类群和欧亚-白令海系统发育类群不同的一个新类群，填补了行业空白，为江鳕种质保护和合理开发利用等相关领域研究提供技术支撑，具有重要意义。附图说明图1为本专利技术实施例1中新疆和黑龙江江鳕线粒体tRNAThr和tRNAPro间非编码区序列PCR扩增电泳图；图2为本专利技术实施例1中新疆和黑龙江江鳕线粒体tRNAThr和tRNAPro间非编码区序列比对图。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术方案作进一步说明：实施例1：一种快速鉴别新疆和黑龙江江鳕的分子生物学方法，其具体技术方案为：步骤1：对采自于新疆额尔齐斯河水系布尔津河和黑龙江水系多布库尔河的江鳕提取基因组DNA；步骤2：利用PCR反应扩增两个地理种群江鳕线粒体DNA的tRNAThr和tRNAPro之间的一段非编码区序列；步骤3：对PCR扩增产物进行电泳分离、染色，构建江鳕DNA电泳模式图；步骤4：采用一代测序技术对该非编码区进行序列测定；步骤5：结合电泳模式图和序列比对结果，鉴定两个种群江鳕。步骤2中PCR反应引物序列为：PF：5′-AGCATCCGTCCTGTACTTCT-3′；PR：5′-CATTAGGGGAACGTAAGTGG-3′。上述引物长度适当，与模板的序列紧密互补，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低，其自身不存在互补序列，自身难以形成发夹结构，与模板的序列能够紧密互补，且延伸温度小于74℃，上、下游引物的GC含量合适，有利于扩增反应的进行，增加PCR产物的量。步骤2中选用北京全式金技术有限公司TransPCRSuperMix系列产品进行PCR反应，其总体系为：12.5μL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速鉴别新疆和黑龙江江鳕的分子生物学方法，其特征在于：所述分子生物学方法的具体技术方案为：步骤1：对采自于新疆额尔齐斯河水系布尔津河和黑龙江水系多布库尔河的江鳕提取基因组DNA；步骤2：利用PCR反应扩增两个地理种群江鳕线粒体DNA的tRNA

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴别新疆和黑龙江江鳕的分子生物学方法，其特征在于：所述分子生物学方法的具体技术方案为：步骤1：对采自于新疆额尔齐斯河水系布尔津河和黑龙江水系多布库尔河的江鳕提取基因组DNA；步骤2：利用PCR反应扩增两个地理种群江鳕线粒体DNA的tRNAThr和tRNAPro之间的一段非编码区序列；步骤3：对PCR扩增产物进行电泳分离、染色，构建江鳕DNA电泳模式图；步骤4：采用一代测序技术对该非编码区进行序列测定；步骤5：结合电泳模式图和序列比对结果，鉴定两个种群江鳕。2.根据权利要求1所述的一种快速鉴别新疆和黑龙江江鳕的分子生物学方法，其特征在于：所述PCR反应引物序列为：PF：5′-AGCATCCGTCCTGTACTTCT-3′；PR：5′-CATTAGGGGAACGTAAGTGG-3′。3.根据权利要求1所述的一种快速鉴别新疆和黑龙江江鳕的分子生物学方法，其特征在于：所述PCR反应总体系为：12.5μL2×EasyTaq®PCRSuperMix(+dye)，10μM的引物各1μL，江鳕基因组DNA0.5-1μg，加灭菌水至终体积25μL。4.根据权利要求1所述的一种快速鉴别新疆和黑龙江江鳕的分子生物学方法，其特征在于：所述CR反应条件为：94℃预变性5min，然后是30个循环，每个循环包括94℃变...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨天燕，孟玮，高天翔，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33