酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法，属于检测技术领域。该酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法包括以下步骤：将蚯蚓投入含有酞酸酯的土壤培养；提取蚯蚓的体腔细胞；对体腔细胞进行检测：本发明专利技术提供的酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法能够准确形象的检测酞酸酯对蚯蚓体腔细胞的毒性结果，并从流式细胞仪获得的各种图谱上直接读取数据进行分析，具有人为干扰小和操作简单的优点。

Detection of toxicity of phthalate esters to coelomic cells of earthworm

The invention provides a method for detecting the toxicity of phthalate esters to the body cavity cells of earthworms, and belongs to the detection technology field. The methods of detecting the toxicity of phthalate to earthworm coelo cells include the following steps: putting earthworms into soil culture with phthalate esters, extracting the body cavity cells of earthworms, and detecting the body cavity cells: the detection method of phthalate on the toxicity of earthworm body cavity cells can accurately and accurately detect phthalate to earthworms. The toxic results of the coelic cells and the direct reading of data from various atlas obtained by the flow cytometry have the advantages of small human interference and simple operation.

【技术实现步骤摘要】
酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法
本专利技术涉及检测
，具体而言，涉及一种酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法。
技术介绍
酞酸酯又称邻苯二甲酸酯，其是邻苯二甲酸形成的酯的统称，主要用作塑料改性添加剂，是一类具有致癌性、致突变性、致畸性、生殖毒性、神经毒性、内分泌干扰性的环境激素。近年来，随着塑料制品的广泛生产和使用，我国的一些江河湖泊、水库、饮用水、和底泥中已呈现出酞酸酯类化合物污染。因此有必要建立相关检测方法实现对土壤中的酞酸酯进行检测以确定。目前用于土壤酞酸酯毒性诊断的试验方法繁多，包括水生生物毒性试验、陆生生物毒性试验和遗传毒性试验，涉及代表性植物、动物和微生物毒性测定方法，不仅试验较为繁琐，试验时间长、诊断效率也较低。因此，需要一种快速、直观、准确的土壤中酞酸酯的毒性检测方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法，其能够准确的检测酞酸酯对蚯蚓体腔细胞的毒性结果。本专利技术是这样实现的：一种酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法，包括以下步骤：将蚯蚓投入含有酞酸酯的土壤培养；提取蚯蚓的体腔细胞；使用流式细胞仪对体腔细胞进行检测。在本专利技术较佳的实施例中，上述将蚯蚓投入含有酞酸酯的土壤培养时，调节土壤的水分至土壤最大持水量的40％～70％。在本专利技术较佳的实施例中，上述土壤中酞酸酯的含量为1～25mg/kg，蚯蚓和含有酞酸酯的土壤的质量比为1～6：400。在本专利技术较佳的实施例中，上述体腔细胞为变形细胞。在本专利技术较佳的实施例中，上述体腔细胞的提取方法是：将培养后的蚯蚓洗净清肠后使用生理盐水浸泡，随后将蚯蚓使用体腔细胞抽提液浸泡得到提取液，将提取液在4℃、2500～3200g下离心20～45min后去除上清液，将下层液和PBS溶液混匀后进行二次离心，去除上清液后加入PBS溶液混匀。在本专利技术较佳的实施例中，上述体腔细胞抽提液由5％～10％体积浓度的无水乙醇和90％～95％体积浓度的生理盐水组成，体腔细胞抽提液中还含有1～2.5mg/mL的EDTA以及5～10mg/mL的愈疮木酚甘油醚。在本专利技术较佳的实施例中，上述对体腔细胞进行检测的方法是：将提取的体腔细胞使用孵育缓冲液洗涤后在4℃、2800～3500g下离心3～6min，将离心后的体腔细胞重悬浮保持细胞浓度为1×106～5×106/mL，随后加入bindingbuffer后孵育20min，加入AV-FITC和PI后孵育15min进行染色后使用流式细胞分析仪进行分析。在本专利技术较佳的实施例中，上述对体腔细胞进行检测的方法是：将提取的体腔细胞和-20℃预冷的乙醇按照1：1～1.5的体积比混匀并在4℃下冷藏12h以上，随后离心收集细胞使用PBS溶液洗涤得到处理液，向处理液中加入含有50μg/mLPI、100μg/mLRNaseA、0.2％TritonX-100的PBS溶液后避光孵育30min，使用流式细胞分析仪进行分析。在本专利技术较佳的实施例中，上述对体腔细胞进行检测的方法是：将提取的体腔细胞中细胞密度调节至106～107/mL，加入10mg/mL的Fluo-3得到浓度为3～4μg/mL的处理液，将处理液孵育30min后在2500～3000g下离心5～10min，去除上清液，向下层液中加入生理盐水重悬后使用流式细胞仪进行分析；其中设置流式细胞仪的激发波长和发射波长分别为488nm和525nm。在本专利技术较佳的实施例中，上述对体腔细胞进行检测的方法是：将100μL10×IncubationBuffer和900μL灭菌去离子水混匀并预热至37℃得到1×IncubationBuffer，将500μL1×IncubationBuffer和1μLJC-1涡旋混匀配成JC-1工作液，使用500μLJC-1工作液将不多于106的体腔细胞悬浮并在37℃和通入5％体积CO2的培养箱中孵育20min，随后在2500～3000g下离心5～10min后收集细胞，用1×IncubationBuffer洗涤两次后再用500μL1×IncubationBuffer重新悬浮细胞，使用流式细胞仪进行分析。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法包括以下步骤：将蚯蚓投入含有酞酸酯的土壤培养；提取蚯蚓的体腔细胞；对体腔细胞进行检测：本专利技术提供的酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法能够准确形象的检测酞酸酯对蚯蚓体腔细胞的毒性结果，并从流式细胞仪获得的各种图谱上直接读取数据进行分析，具有人为干扰小和操作简单的优点。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为使用实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5和对比例中方法检测的结果绘制得到的双变量流式细胞仪散点图；图2为使用实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5和对比例中方法检测得到的蚯蚓的凋亡率和死亡率；图3为为使用实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5和对比例中方法检测得到的蚯蚓体腔细胞的G2/G1期的周期变化；图4为为使用实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5和对比例中方法检测得到的蚯蚓体腔细胞的S期的周期变化；图5为为使用实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5和对比例中方法检测得到的蚯蚓体腔细胞的胞内钙离子浓度；图6为为使用实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5和对比例中方法检测得到的蚯蚓体腔细胞的线粒体膜电位。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。其中，愈创木酚甘油醚(≥98％，C10H14O4)购自Sigma试剂公司(St.Louis，MO)；中性红购自美国BBI生化试剂公司；NaCl、KH2PO4、Na2HPO4、NaOH、KCl、EDTA、CH3COOH、无水乙醇和丙酮均为分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司、南京化学试剂有限公司。用于流式细胞分析的试剂盒(AV-FITC/PI双染凋亡试剂盒、细胞周期试剂盒、胞内钙离子测定试剂盒和线粒体膜电位测定试剂盒)均购自美国BD生物公司(Pharmingen，USA)。下面对本专利技术实施例进行具体说明。本实施例提供了一种酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法，包括以下步骤：S1、将蚯蚓投入含有酞酸酯的土壤培养；其中土壤中酞酸酯的含量优选为1～25mg/kg，蚯蚓和含有酞酸酯的土壤的质量比优选为1～6：400；优选的，将蚯蚓投入含有酞酸酯的土壤培养时，调节土壤的水分至土壤最大持水量的40％～70％。S2、提取蚯蚓的体腔细胞；优选的提取的体腔细胞为变形细胞；体腔细胞的提取方法是：将培养后的蚯蚓洗净清肠后使用生理盐水浸泡，随后将蚯蚓使用体腔细胞抽提液浸泡得到提取液，将提取液在4℃、2500～3200g下离心20～45min后去除上清液，将下层液和PBS溶液混匀后进行二次离心，去除本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将蚯蚓投入含有酞酸酯的土壤培养；提取所述蚯蚓的体腔细胞；使用流式细胞仪对所述体腔细胞进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将蚯蚓投入含有酞酸酯的土壤培养；提取所述蚯蚓的体腔细胞；使用流式细胞仪对所述体腔细胞进行检测。2.根据权利要求1所述的酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法，其特征在于，将所述蚯蚓投入所述含有酞酸酯的土壤培养时，调节所述土壤的水分至土壤最大持水量的40％～70％。3.根据权利要求1所述的酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法，其特征在于，所述土壤中酞酸酯的含量为1～25mg/kg，所述蚯蚓和所述含有酞酸酯的土壤的质量比为1～6：400。4.根据权利要求1所述的酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法，其特征在于，所述体腔细胞为变形细胞。5.根据权利要求1所述的酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法，其特征在于，所述体腔细胞的提取方法是：将培养后的所述蚯蚓洗净清肠后使用生理盐水浸泡，随后将蚯蚓使用体腔细胞抽提液浸泡得到提取液，将所述提取液在4℃、2500～3200g下离心20～45min后去除上清液，将下层液和PBS溶液混匀后进行二次离心，去除上清液后加入PBS溶液混匀。6.根据权利要求5所述的酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法，其特征在于，所述体腔细胞抽提液由5％～10％体积浓度的无水乙醇和90％～95％体积浓度的生理盐水组成，所述体腔细胞抽提液中还含有1～2.5mg/mL的EDTA以及5～10mg/mL的愈疮木酚甘油醚。7.根据权利要求1所述的酞酸酯对蚯蚓体腔细胞毒性的检测方法，其特征在于，对所述体腔细胞进行检测的方法是：将提取的所述体腔细胞使用孵育缓冲液洗涤后在4℃、2800～3500g下离心3～6min，将离心后的所述体腔细胞重悬浮保持细胞浓度为1×106～5×106/mL，随后加入bindingbuffer后孵育20min，加入AV-FITC和PI后孵...

【专利技术属性】
技术研发人员：马婷婷，周炜，骆永明，
申请(专利权)人：湖北文理学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42