一种子宫内膜干细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术涉及一种子宫内膜干细胞分离培养方法，所述方法包括以下步骤：1)采集经血样本；2)子宫内膜干细胞的分离；3)子宫内膜干细胞的原代培养。该方法分离得到的子宫内膜干细胞纯度高，原代培养的细胞增殖活性高，传代培养的细胞活率高，污染率低。

A method of isolation and culture of endometrial stem cells

The present invention relates to a method for isolation and culture of endometrium stem cells. The methods include the following steps: 1) collecting blood samples; 2) isolation of endometrium stem cells; 3) primary culture of endometrial stem cells. The purified endometrial stem cells obtained by this method have high purity, high primary cell proliferation, high cell viability and low contamination rate.

【技术实现步骤摘要】
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法
本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及一种子宫内膜干细胞的分离培养方法。
技术介绍
人类子宫内膜功能层在月经周期手提内激素的作用发生周期性的增生和脱落，早年即有学者提出子宫内膜显著的增生能力可能源于子宫内膜干细胞的存在，大量的临床观察和基础研究均显示，子宫内膜干细胞可能成为子宫内膜过薄和内膜病变患者进行内膜修复替代治疗的手段，同时可为内膜异位症、子宫内膜癌等提供新的研究思路；子宫作为人体中具有超强再生能力的器官，其子宫内膜在么个月经周期中会增长约5-7cm，而以这种增长速率，子宫内膜会在妇女育龄期经过500次左右有规律的脱落和再生过程，同时，经血的获得不具有侵入性，不会对供者造成伤害，来源广泛，且对其研究不会涉及伦理道德和法律问题，此外，还具有采集方便等特性，因此成为寻找子宫内膜干细胞的新来源及提高临床应用效果的研究热点。使用常规手段分离经血内的子宫内膜干细胞主要存在以下问题：1分离液使用量大，离心后部分红细胞仍然悬浮在分离液中，致使收集到的细胞中混杂较多的红细胞，制得的子宫内膜干细胞纯度差；2.红细胞层内也混杂有子宫内膜干细胞，致使细胞收率较低；3.较长时间的离心对细胞的活性造成损伤；4.经血样本向本外周血样本较为复杂，存在较多粘液物质及大量血凝块，杂质较多；5.子宫内膜干细胞使用培养基成分较多，价格昂贵，且体外培养10代以上，细胞容易出现衰老、退化的现象，增殖效率低，且在培养基中添加较多的细胞生长因子，会促进干细胞分化，对于维持其感性与稳定性不利，影响干细胞储存于研究质量。
技术实现思路
针对以上人子宫内膜干细胞分离过程中存在的大量问题，本专利技术提供了一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，该方法分离培养的子宫内膜干细胞纯度高，传代培养15代后细胞活率依然高达94.5％，同时，该方法培养得到的子宫内膜干细胞污染率低，多次传代后的干细胞具有多向分化的潜能。本专利技术具体技术方案如下：一种子宫内膜干细胞分离培养方法，该方法包括以下步骤：1)采集经血样本；2)子宫内膜干细胞的分离：取100-200重量份的步骤1)采集的经血样本，与20-40重量份的浓度为0.9％的氯化钠注射液混合均匀，放置于多功能振荡器上振摇20-30min，加入淋巴细胞分离液，离心，得到四层分离液，吸出底层分离液，即得A液，去除顶层透明液体，再加入1-2重量份的HES和1.5-2.5重量份的消化酶混合均匀，将混合液倒入离心管中，将离心管放置于离心机中离心6-8min，弃上清，取沉淀，即得B液，将A液和B液用同体积的PBS缓冲液洗涤，过200μm细胞筛网，收集子宫内膜干细胞；3)子宫内膜干细胞的原代培养：将步骤2)分离得到的子宫内膜干细胞进行原代培养，得原代培养细胞。其中，HES为羟乙基淀粉，消化酶为任意一种消化酶，如胃蛋白酶等。进一步改进，步骤3)具体包括以下步骤：3)子宫内膜干细胞的培养：将步骤2)收集的子宫内膜干细胞接种到原代培养基上进行原代培养，培养条件为：将原代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养的前两天每天向培养基中添加浓度为2％-5％的海藻糖、5％-10％的腺嘌呤和5％-10％的酪氨酸，待细胞融合至85％-90％，即得原代培养细胞；其中，所述原代培养基为包括2％-5％的甘露醇、10％-14％的氯化镁、2％-5％的SOD和1％-2％的NAC的MEM培养基。其中，接种密度为1×106，SOD为超氧化物歧化酶，NAC为N-乙酰半胱氨酸，MEM培养基包括如下成分：200mg/L的无水氯化钙、93.5mg/L的无水硫酸镁、400mg/L的氯化钾、6800mg/L的氯化钠、115mg/L的无水磷酸二氢钠、126mg/L的L-盐酸精氨酸、31.4mg/L的L-盐酸胱氨酸、42mg/L的L-盐酸组氨酸、52mg/L的L-异亮氨酸、52mg/L的L-亮氨酸、73mg/L的L-盐酸赖氨酸、15mg/L的L-甲硫氨酸、32mg/L的L-苯丙氨酸、40mg/L的L-苏氨酸、10mg/L的L-色氨酸、0.02mg/L的生物素、36mg/L的L-酪氨酸、40mg/L的L-缬氨酸、1.8mg/L的酒石酸胆碱、1mg/L的叶酸、2mg/L的肌醇、1mg/L的烟氨酸、1mg/L的D-泛酸钙、1mg/L的盐酸吡哆辛、0.1mg/L的核黄素、1mg/L的盐酸硫胺、1000mg/L的葡萄糖、75mg/L的丁二酸、100mg/L的丁二酸钠.6H2O，6mg/L的酚红、60mg/L的卡那霉素。本专利技术通过以上方法对细胞进行原代培养，可以显著的提高细胞的增殖活性，并可进行多次传代。进一步改进，步骤3)所述的原代培养方法为：将步骤2)制得的子宫内膜干细胞接种于原代培养基上，将原代培养基放置于光照强度为5000-8000lx的条件下照射5-10min，再将培养基放置于培养箱中培养；其中，原代培养基在光照照射前添加浓度为10-20ng/mL的生育酚琥珀酸单酯、5-15ng/mL的聚乳酸、20-40ng/mL的肝素和12-16ng/mL的唑菌胺酯。本专利技术通过限定原代培养的方法，可显著的降低原代培养细胞的污染率，为后续的传代培养提供良好的基础。进一步改进，子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：4)细胞传代培养：将原代培养得到的原代培养细胞接种于传代培养基上进行传代培养，其中，传代培养方法为：将传代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养6-7天后，更换培养基，弃除未贴壁细胞，培养至第5代后，每天向传代培养基中加入20-40重量份的增活剂，待细胞生长达到90-95％融合时用质量浓度为3％的胰蛋白酶消化收集细胞，即得传代培养细胞。进一步改进，增活剂由以下重量份的组分组成：5-10的D-半乳糖、1-2的NGF、2-5的维生素C、2-5的HEPES、5-8的罂粟碱和5-10的氯化钠。其中，传代培养的接种密度为1×106，NGF为神经生长因子，HEPES为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，本专利技术通过以上方法对细胞进行传代培养，有利于子宫内膜干细胞数量的增长，得到的干细胞数量多，传代15次后，干细胞依然保持较高的活率。进一步改进，多功能振荡器的震荡速度为30-50r/min，所述离心机的离心速度为1000-1500r/min。进一步改进，子宫内膜干细胞的分离培养方法还包括以下步骤：5)冻存：用2-5℃的冻存液重悬步骤4)获得的传代培养细胞，使细胞的密度为1-2×107/ml，放入冻存盒中采用程序降温，最后转入-196℃液氮保存。进一步改进，程序降温包括如下步骤：4℃0.5-1h，-10℃1-2h，-30℃0.5-1h，-80℃12h。本专利技术通过以上冻存方法，可延长细胞的保质期，使其在保存96个月后，细胞的存活率依然符合要求。本专利技术提供了一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，该方法分离得到的子宫内膜干细胞纯度高，原代培养的细胞增殖活性高，传代培养的细胞活率高，污染率低。实施例1一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1)采集经血样本；2)子宫内膜干细胞的分离：取100重量份的步骤1)采集的经血样本，与20重量份的浓度为0.9％的氯化钠注射液混合均匀，放置于多功能振荡器上振摇20min，取出本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)采集经血样本；2)子宫内膜干细胞的分离：取100‑200重量份的步骤1)采集的经血样本，与20‑40重量份的浓度为0.9％的氯化钠注射液混合均匀，放置于多功能振荡器上振摇20‑30min，加入淋巴细胞分离液，离心，得到四层分离液，吸出底层分离液，即得A液，去除顶层透明液体，再加入1‑2重量份的HES和1.5‑2.5重量份的消化酶混合均匀，将混合液倒入离心管中，将离心管放置于离心机中离心6‑8min，弃上清，取沉淀，即得B液，将A液和B液用同体积的PBS缓冲液洗涤，过200μm细胞筛网，收集子宫内膜干细胞；3)子宫内膜干细胞的原代培养：将步骤2)分离得到的子宫内膜干细胞进行原代培养，得原代培养细胞。

【技术特征摘要】
1.一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)采集经血样本；2)子宫内膜干细胞的分离：取100-200重量份的步骤1)采集的经血样本，与20-40重量份的浓度为0.9％的氯化钠注射液混合均匀，放置于多功能振荡器上振摇20-30min，加入淋巴细胞分离液，离心，得到四层分离液，吸出底层分离液，即得A液，去除顶层透明液体，再加入1-2重量份的HES和1.5-2.5重量份的消化酶混合均匀，将混合液倒入离心管中，将离心管放置于离心机中离心6-8min，弃上清，取沉淀，即得B液，将A液和B液用同体积的PBS缓冲液洗涤，过200μm细胞筛网，收集子宫内膜干细胞；3)子宫内膜干细胞的原代培养：将步骤2)分离得到的子宫内膜干细胞进行原代培养，得原代培养细胞。2.如权利要求1所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤3)具体包括以下步骤：3)子宫内膜干细胞的培养：将步骤2)收集的子宫内膜干细胞接种到原代培养基上进行原代培养，培养条件为：将原代培养基放置于37±1℃，体积分数为5％CO2的饱和湿度的培养箱中，培养的前两天每天向培养基中添加浓度为2％-5％的海藻糖、5％-10％的腺嘌呤和5％-10％的酪氨酸，待细胞融合至85％-90％，即得原代培养细胞；其中，所述原代培养基为包括2％-5％的甘露醇、10％-14％的氯化镁、2％-5％的SOD和1％-2％的NAC的MEM培养基。3.如权利要求2所述的子宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤3)所述的原代培养方法为：将步骤2)制得的子宫内膜干细胞接种于原代培养基上，将原代培养基放置于光照强度为5000-8000lx的条件下照射5-10min，再将培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹毓琳，刘俊江，时兆田，白志惠，
申请(专利权)人：北京臻溪谷医学研究中心有限合伙，
类型：发明
国别省市：北京,11