一种可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的制备方法，包括将从人尿中提取的尿蛋白浓缩液依次经金属螯合亲和层析柱、阴离子层析柱、凝血酶亲和层析柱、疏水层析柱层析，得到血凝调节蛋白。本发明专利技术提供的方法操作简单方便，成本低，收率高，且制备得到的血凝调节蛋白属纯人源性产品，无异源蛋白污染，更安全可靠，生物活性高，无免疫原性，质量稳定，适合大规模生产操作。

A method for preparation of human derived hemagglutination regulatory protein from industrial production

The invention discloses a preparation method of a human source of blood coagulating protein which can be produced in industrial production, including the urine protein concentrate extracted from human urine by metal chelating affinity chromatography column, anionic chromatography column, thrombin affinity chromatography column, and hydrophobic column chromatography to obtain the blood coagulation regulatory protein. The method provided by the invention has simple and convenient operation, low cost, high yield, and the prepared hemagglutination protein is a pure human derived product, no source protein pollution, more safe and reliable, high biological activity, no immunogenicity, stable quality, suitable for large-scale production operation.

【技术实现步骤摘要】
一种可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的制备方法
本专利技术涉及一种人来源血凝调节蛋白的制备方法，特别涉及一种可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的大规模制备新方法。
技术介绍
血凝调节蛋白(Thrombomodulin，TM)又称凝血酶调节蛋白，是存在于血管内皮细胞膜上的单链跨膜糖蛋白，完整分子的相对分子质量为75,000Da，降解二硫键后相对分子质量为105,000Da，由575个氨基酸组成。TM最初由N.L.Esmon等于1981年在实验中发现，其结构包括一个氨基端的植物凝集样结构域，6个重复排列的内皮生长因子(endothelialgrowthfactor，EGF)样结构域，一个丝氨酸/苏氨酸富集区(疏水区域)，一个跨膜区和一个短的细胞内尾端。凝血酶调节蛋白的结构如图3所示。TM因具有强力的血液凝固阻断作用而为人所知，其通过与凝血酶特异性结合来阻断凝血酶的血液凝固活性，同时TM能够显著促进凝血酶的蛋白质C(ProteinC，PC)的活化，是PC抗凝途径的重要辅因子。临床上TM能够预防与治疗冠状动脉综合症(ACS)、血栓症、外周血管阻塞、闭塞性动脉硬化、血管炎、心脏手术后的功能性障碍、器官移植、心绞痛、短暂性脑缺血引起的并发症、妊娠毒血症、糖尿病、肝静脉阻塞病(liverVOD)、深静脉血栓(DVT)，急性呼吸窘迫综合症(ARDS)等。目前，主要是用于凝血系统紊乱而致的弥散性血管内凝血(DIC)。TM不仅是重要的抗凝辅助因子，也是反映血管内皮细胞损伤的分子标志，多种累及血管内皮损伤的疾病，如系统性红斑狼疮、糖尿病、白血病等，TM都有增高；越来越多的研究表明，TM可作为一种具有实际应用价值新的肿瘤标志物。因此，TM具有很高的临床应用价值。TM有两种存在形式：固定型(膜型)和溶解型(血液型)。前者存在于细胞表面，后者游离于血浆和尿液中。溶解型TM(solublethrombomodulin，sTM)由557个氨基酸残基构成，分子量约为60,300D，等电点约为3.8，其结构是固定型TM去除部分或全部的跨膜区域，sTM与天然TM具有相同的功效和理化性质。研究显示在人血浆中TM含量为292±60ng/mL，人尿中TM含量为102±38ng/mL。据报道，TM已经能从胎盘、肺和血液中提取出来，但是他们不适于大规模生产，除此之外，制备TM的原料在处理过程中常常需要外源加入表面活性剂、去污剂等物质，处理过程较为复杂，且容易带入污染物，为后续纯化增加难度。以考虑到TM在药品中的应用为前提，需要大量地且以更低成本来获得可溶性血栓调节蛋白，目前有市售的日本旭化成公司的重组可溶性TM，但TM是一种糖蛋白，通过基因工程技术无法制备与天然结构具有相同糖链的目标蛋白，糖链的差异可能导致蛋白具有截然相反的生物功能，导致蛋白药物具有负面效应。另有多个文献报道人尿适于用作分离天然型TM的起始原料，例如Yamamoto等纯化TM的过程使用了QAE交联葡聚糖，抗TM单克隆抗体柱，凝血酶作为配体的亲和柱和交联葡聚糖G-200，但由于此方法需要制备单克隆抗体，过程较为复杂。再如D.E.Jackson等纯化TM时结合使用了DEAE琼脂糖凝胶，凝血酶作为配体的亲和柱和反向HPLC，此方法中反向HPLC产量低且不适于大规模纯化，另外，Aoki等(日本专利申请公开No.Sho-63-30423)和Kunihiro等(日本专利申请公开No.Sho-63-218399)报道了从新鲜尿液中纯化TM的方法，使用了离子交换色谱，凝血酶结合的亲和柱和凝胶渗透，结果证明当TM含量很低时，此方法不适用。综上可以看出目前从人尿中提取TM的各种纯化方法均表现为产量低且不适于大规模工业化生产。
技术实现思路
专利技术目的：为了能够简单方便、成本低、收率高的大规模工业化生产得到无异源蛋白污染、更安全可靠、生物活性高、无免疫原性、质量稳定的纯人源性血凝调节蛋白，本专利技术提供了一种可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的制备方法。技术方案：本专利技术所述的可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的制备方法，包括将从人尿中提取的尿蛋白浓缩液依次经金属螯合亲和层析柱、阴离子层析柱、凝血酶亲和层析柱、疏水层析柱层析，得到血凝调节蛋白。所述的尿蛋白浓缩液由以下步骤制备得到：利用离子交换树脂作为吸附剂吸附尿液中的尿蛋白，清洗、解吸附，超滤浓缩，即得尿蛋白浓缩液。其中，所述的离子交换树脂优选为大孔径离子交换树脂。所述的尿蛋白浓缩液由以下更具体的步骤制备得到：将离子交换树脂作为吸附剂放置在尿池或尿斗中，吸附流经尿液或稀释尿液中的尿蛋白；收集已吸附尿蛋白的树脂，集中进行清洗，解吸附，超滤浓缩，即得尿蛋白浓缩液。所述的解吸附为利用0.5～1.5mol/L的NaCl水溶液进行尿蛋白的解吸附。所述的离子交换树脂为阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、阴阳离子混合树脂或者同时具有阳离子交换基团和阴离子交换基团的两性树脂。采用平衡液平衡好的金属螯合亲和层析柱层析，上样尿蛋白浓缩液，经洗脱液洗脱后收集洗脱峰；尿蛋白浓缩液上样金属鳌合亲和层析柱之前需要调节pH与电导，调节pH为5.0-8.0，电导0.5-10mS/cm。所述的金属鳌合亲和层析柱的鳌合金属离子是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+中的任意一种，优选为Cu2+，其层析时所用的平衡液为0.02-0.2mol/L醋酸盐或磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含0.05-0.5mol/LNH4Ac；洗脱液为0.02-0.2mol/L磷酸盐水溶液，所述水溶液含0.05-0.5mol/LNH4Ac和0.02-0.2mol/L咪唑，pH为6.0-8.0。平衡液优选0.1mol/L磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含0.1mol/LNH4Ac，pH为6.0；洗脱液优选0.1mol/L磷酸盐水溶液，所述水溶液含0.1mol/LNH4Ac和0.1mol/L咪唑，pH为7.0。在洗脱金属螯合亲和层析柱之前加入冲洗步骤，冲洗液为0.02-0.2mol/L磷酸盐或者醋酸盐水溶液，所述水溶液含0.1-0.5mol/LNH4Ac，pH为5.0-8.0。冲洗液优选0.1mol/L磷酸盐水溶液，所述水溶液含0.2mol/LNH4Ac，pH为6.0。采用平衡好的阴离子层析柱层析，上样金属螯合亲和层析的洗脱峰样品，该洗脱峰样品上样前，超滤浓缩，调节pH为5-8，电导0.2-2mS/cm。所述的阴离子层析柱优选为DEAE-琼脂糖凝胶柱。所述的阴离子层析柱平衡洗脱液为0.02-0.2mol/L磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，所述缓冲液pH为5-8。平衡洗脱液优选0.02mol/L磷酸盐缓冲液，pH为7.0。采用平衡好的凝血酶亲和层析柱层析，上样离子交换层析的冲洗穿透峰，调节pH为5-7，电导0.5-5mS/cm。所述的凝血酶亲和层析柱平衡液为0.02-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含0.1-0.8mol/LNaCl，pH为5-7；洗脱液为0.02-0.2mol/L磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含0.5-1.5mol/LNaCl，pH为5-7。平衡液优选0.02mol/L磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含0.2mol/LNaCl，pH为6.0；洗脱液优选0.02mol/L磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含1.0mol/LNaCl，pH为6.0。所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的制备方法，其特征在于，包括将从人尿中提取的尿蛋白浓缩液依次经金属螯合亲和层析柱、阴离子层析柱、凝血酶亲和层析柱、疏水层析柱层析，得到血凝调节蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的制备方法，其特征在于，包括将从人尿中提取的尿蛋白浓缩液依次经金属螯合亲和层析柱、阴离子层析柱、凝血酶亲和层析柱、疏水层析柱层析，得到血凝调节蛋白。2.根据权利要求1所述的可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的制备方法，其特征在于，所述的尿蛋白浓缩液由以下步骤制备得到：利用离子交换树脂作为吸附剂吸附尿液中的尿蛋白，清洗、解吸附，超滤浓缩即得尿蛋白浓缩液。3.根据权利要求2所述的可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的制备方法，其特征在于，所述的解吸附为利用0.5～1.5mol/L的NaCl水溶液进行尿蛋白的解吸附。4.根据权利要求1所述的可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的制备方法，其特征在于，所述的金属鳌合亲和层析柱的鳌合金属离子是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+中的任意一种，其层析时所用的平衡液为0.02-0.2mol/L醋酸盐或磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含0.05-0.5mol/L的NH4Ac；洗脱液为0.02-0.2mol/L磷酸盐水溶液，所述水溶液含0.05-0.5mol/LNH4Ac和0.02-0.2mol/L咪唑，pH为6.0-8.0。5.根据权利要求4所述的可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的制备方法，其特征在于，冲洗液...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯晓彦，傅和亮，李文全，袁玉，王筱蒙，居维艳，
申请(专利权)人：江苏艾迪药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32