一种人脂肪干细胞的获取分离培养方法和干细胞库的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种人脂肪干细胞的获取分离培养方法和干细胞库的构建方法，该分离培养方法包括人脂肪组织的采集；人脂肪组织的处理；人脂肪干细胞的消化；人脂肪干细胞的培养，干细胞库的构建方法包括人脂肪干细胞的获取分离培养；对获取的每一份人脂肪干细胞进行ID编号，记录获取每一份人脂肪干细胞的供者信息，将ID编号与供者信息进行链接形成细胞信息档案保存至数据库中，即形成人脂肪干细胞库。本发明专利技术提供的人脂肪干细胞的分离培养方法中不仅脂肪组织效果更加彻底，而且培养时间短，在培养过程中，特定的培养基能够使细胞增殖更快，干细胞纯度更高，细胞在培养过程中没有出现干细胞分化现象，细胞冻存过程中存活率更高。

A method for isolation, culture and establishment of stem cell bank of human adipose derived stem cells

The invention provides a method for obtaining and separating human fat stem cells and building a stem cell bank, which includes the collection of human fat tissue, the treatment of human adipose tissue, the digestion of human fat stem cells, the cultivation of human fat stem cells, and the construction of stem cell banks including human fat stem cells. The ID number of each human fat stem cell was numbered, the donor information of each human fat stem cell was recorded, and the ID number was linked to the donor information to form the cell information file to be stored in the database, that is, the adult fat stem cell bank. In the method of isolation and culture of human fat stem cells provided by this invention, not only the effect of adipose tissue is more thorough, but also the culture time is short. In the process of culture, the specific medium can make the cell proliferation faster, the purity of stem cells is higher, the cell differentiation is not appeared during the culture process, and the cell freezing process is in the process of cell cryopreservation. The survival rate is higher.

【技术实现步骤摘要】
一种人脂肪干细胞的获取分离培养方法和干细胞库的构建方法
本专利技术属于医学和生物学
，特别涉及一种人脂肪干细胞的获取分离培养方法和干细胞库的构建方法。
技术介绍
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化为多种功能细胞。干细胞即为起源细胞，简单来讲，它是具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。脂肪干细胞是从脂肪组织获得的一类有多向分花潜能的干细胞，其在特定诱导条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞等。Zuk2001年首次通过分离人脂肪组织获得了此类具有细胞治疗潜能的干细胞，从而开创了脂肪干细胞研究和应用的先河。目前，现有的人体脂肪干细胞的分离及培养均存在组织消化低，脂肪干细胞的增值缓慢，细胞分化严重，细胞培养过程中存活率低，此外，为了便于人们有效储存和使用干细胞资源，目前在世界范围内，已经建立了多个干细胞库，一个完善的干细胞库应具备随时随地将储存的健康干细胞提供临床使用的能力，目前现有技术中构建的脂肪干细胞库为存储本人、家属和他人在需要采用脂肪成体干细胞移植及相关技术治疗的各种疾病时，提供临床使用型脂肪成体干细胞，其应用前景十分广阔，但是现有的脂肪干细胞库配置不够完善，数据存储简单，无法满足临床研究及日后医用的需求。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供了一种人脂肪干细胞的获取分离培养方法和干细胞库的构建方法。本专利技术具体技术方案如下：本专利技术提供了一种人脂肪干细胞的获取分离培养方法，该方法包括以下步骤：S1、人脂肪组织的采集：在无菌环境下采集供者的脂肪组织，置于体积比为3-4:1-2的0.9％的氯化钠注射液中清洗干净，去除坏死组织和结缔组织，将脂肪组织剪成0.5-3.5mm3大小；S2、人脂肪组织的处理：将脂肪组织收集于离心管中，在1800-2200rpm/min的条件下离心处理15min，收集上层部分的脂肪层，并用PBS洗涤；S3、人脂肪干细胞的消化：加入等体积的消化酶在温度为30-37℃的环境下进行20-45min的消化处理，加入等体积的含10％血清的DMEM完全培养基终止消化，静置20min后，去掉上层，在1200-1500rpm/min的条件下离心5-8min，弃上清，收集下层的人脂肪干细胞；S4、人脂肪干细胞的培养：将人脂肪干细胞以2×106细胞/瓶的密度接种于盛有培养基的培养瓶中，在温度为30-37℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养即完成对人脂肪干细胞的扩大培养。通过上述方法能够使组织消化更加彻底，同时在细胞培养过程中能够有效提高干细胞的培养效率，而且能够抑制干细胞分化。进一步的，步骤S3中，所述消化酶是以D-Hanks平衡盐溶液配制的混合胶原酶，所述混合胶原酶还包括K脂酶、Ⅰ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶，100mLD-Hanks平衡盐溶液中含有0.1-0.3gK脂酶、0.5-0.8gⅠ型胶原酶、0.3-0.5gⅣ型胶原酶。通过将K脂酶、Ⅰ型胶原酶和Ⅳ型胶原酶混合组成的混合胶原酶能够使脂肪组织效果更加彻底，能够明显降低杂细胞数量，细胞培养中纯度更高。进一步的，步骤S4中，所述培养基以MEM培养基为基础，其还包括以下浓度组分：80-150ng/mL的人血清白蛋白、100-200ng/mL的葡萄糖酸钠、120-180ng/mL的乳糖醛酸。本专利技术提供的培养基中加入的人血清白蛋白、葡萄糖酸钠、乳糖醛酸为人脂肪干细胞的培养提供了充足的营养成分，同时为人脂肪干细胞的培养过程提供了安全的培养环境，提高了脂肪干细胞的免疫力，有效降低细胞培养过程中的死亡率。进一步的，该方法还包括以下步骤：S5、人脂肪干细胞的冻存：将扩大培养的人脂肪干细胞置于冻存液中，迅速移入至-80℃的环境下冻存，24小时后，转移至液氮中长期保存。大量培养的人脂肪干细胞在扩大培养后通过上述方法进行冻存，在冻存前需要对细胞进行检测，细胞经过安全检测后进行冻存，为后期应用提供便利。进一步的，步骤S5中，所述冻存液包括以下浓度的组分：20-50mL/L的胎牛血清、5-8mL/L的肝素钠、3-8mL/L的亚硒酸钠和8-12mL/L的N-乙酰半胱氨酸。本技术方案中，冻存液中加入的胎牛血清为细胞的存储提供了充足的营养，肝素钠的加入作为低温保护剂使用，提高了冻存液的稳定性，为细胞提供一个适宜的生存环境，降低细胞在冻存过程中的死亡率，延长细胞的保存时间；亚硒酸钠可以促进氢过氧化物代谢，消除保护液中氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害，这一点上对干细胞具有良好的损伤保护作用。进一步的，步骤S5中，人脂肪干细胞冻存时细胞密度为4×107-8×107个细胞/mL。优选的，所述的人脂肪干细胞的获取分离培养方法在人脂肪干细胞库的构建中的应用。本专利技术还提供了一种人脂肪干细胞库的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：步骤Ⅰ、按照人脂肪干细胞的获取分离培养方法获取人脂肪干细胞；步骤Ⅱ、对获取的每一份人脂肪干细胞进行ID编号，记录获取每一份人脂肪干细胞的供者信息，将ID编号与供者信息进行链接形成细胞信息档案保存至数据库中，即形成人脂肪干细胞库，其中，所述供者信息包括供者姓名、性别、HLA分型、ABO/Rh血型、身份证号、存储日期及联系方式。通过上述方法构建的人脂肪干细胞库能够大量存储纯度较高的人脂肪干细胞，方便后期应用。进一步的，所述步骤Ⅱ还包括以下步骤：所述数据库能够通过所述供者信息对所述数据库中的人脂肪干细胞的ID编号进行检索。优选的，所述构建方法还包括以下步骤：采用RSA公钥加密算法对所述数据库内的细胞信息档案进行加密设置同时生成解密密码发送至供者。本专利技术的有益效果如下：本专利技术提供的人脂肪干细胞的分离培养方法中不仅脂肪组织效果更加彻底，而且培养时间短，在培养过程中，特定的培养基能够使细胞增殖更快，干细胞纯度更高，细胞在培养过程中没有出现干细胞分化现象，细胞冻存过程中存活率更高。具体实施方式下面结合以下实施例对本专利技术作进一步详细说明。实施例1本专利技术实施例1提供了一种人脂肪干细胞的获取分离培养方法，该方法包括以下步骤：S1、人脂肪组织的采集：在无菌环境下采集供者的脂肪组织，置于体积比为3:1的0.9％的氯化钠注射液中清洗干净，去除坏死组织和结缔组织，将脂肪组织剪成0.5mm3大小；S2、人脂肪组织的处理：将脂肪组织收集于离心管中，在1800rpm/min的条件下离心处理15min，收集上层部分的脂肪层，并用PBS洗涤；S3、人脂肪干细胞的消化：加入等体积的消化酶在温度为30℃的环境下进行20min的消化处理，加入等体积的含10％血清的DMEM完全培养基终止消化，静置20min后，去掉上层，在1200rpm/min的条件下离心5min，弃上清，收集下层的人脂肪干细胞；S4、人脂肪干细胞的培养：将人脂肪干细胞以2×106细胞/瓶的密度接种于盛有培养基的培养瓶中，在温度为30℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养即完成对人脂肪干细胞的扩大培养。实施例2本专利技术实施例2提供了一种人脂肪干细胞的获取分离培养方法，该方法包括以下步骤：S1、人脂肪组织的采集：在无菌环境下采集供者的脂肪组织，置于体积比为4:1的0.9％的氯化钠注射液中清洗干净，去除坏死组织和结缔组织，将脂肪组织剪成2mm3大本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人脂肪干细胞的获取分离培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：S1、人脂肪组织的采集：在无菌环境下采集供者的脂肪组织，置于体积比为3‑4:1‑2的0.9％的氯化钠注射液中清洗干净，去除坏死组织和结缔组织，将脂肪组织剪成0.5‑3.5mm

【技术特征摘要】
1.一种人脂肪干细胞的获取分离培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：S1、人脂肪组织的采集：在无菌环境下采集供者的脂肪组织，置于体积比为3-4:1-2的0.9％的氯化钠注射液中清洗干净，去除坏死组织和结缔组织，将脂肪组织剪成0.5-3.5mm3大小；S2、人脂肪组织的处理：将脂肪组织收集于离心管中，在1800-2200rpm/min的条件下离心处理15min，收集上层部分的脂肪层，并用PBS洗涤；S3、人脂肪干细胞的消化：加入等体积的消化酶在温度为30-37℃的环境下进行20-45min的消化处理，加入等体积的含10％血清的DMEM完全培养基终止消化，静置20min后，去掉上层，在1200-1500rpm/min的条件下离心5-8min，弃上清，收集下层的人脂肪干细胞；S4、人脂肪干细胞的培养：将人脂肪干细胞以2×106细胞/瓶的密度接种于盛有培养基的培养瓶中，在温度为30-37℃，5％CO2饱和湿度的培养箱中培养即完成对人脂肪干细胞的扩大培养。2.如权利要求1所述的人脂肪干细胞的获取分离培养方法，其特征在于，步骤S3中，所述消化酶是以D-Hanks平衡盐溶液配制的混合胶原酶，所述混合胶原酶还包括K脂酶、Ⅰ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶，100mLD-Hanks平衡盐溶液中含有0.1-0.3gK脂酶0.5-0.8gⅠ型胶原酶、0.3-0.5gⅣ型胶原酶。3.如权利要求2所述的人脂肪干细胞的获取分离培养方法，其特征在于，步骤S4中，所述培养基以MEM培养基为基础，其还包括以下浓度组分：80-150ng/mL的人血清白蛋白、100-200ng/mL的葡萄糖酸钠、120-180ng/mL的乳糖醛酸。4.如权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹毓琳，刘俊江，时兆田，白志惠，
申请(专利权)人：北京臻溪谷医学研究中心有限合伙，
类型：发明
国别省市：北京,11