一种基于锌的功能核酸的耐高盐比色传感器及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于锌的功能核酸的耐高盐比色传感器及其应用。该耐高盐比色传感器包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，所述分子识别元件包括锌离子脱氧核酶，锌离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系，等温扩增体系包括扩增模板；所述信号转换元件包括硫代黄色素。分子识别元件识别锌离子，并将产生扩增产物，扩增产物在硫代黄色素作用下，形成G‑四链体结构，通过检测荧光强度，计算得出锌离子浓度。本发明专利技术传感器基于锌离子脱氧核酶、等温指数放大反应和G‑四链体液相传感技术，可用于环境中锌离子的现场检测，操作简便快捷、成本低廉、灵敏度高、选择性好。

【技术实现步骤摘要】
一种基于锌的功能核酸的耐高盐比色传感器及其应用
本专利技术属于离子检测
，具体涉及一种基于锌的功能核酸的耐高盐比色传感器及其应用。
技术介绍
重金属锌(Zinc，Zn)是自然界中分布较广的金属元素，主要以硫化锌和氧化锌状态存在，也可与很多元素如铅、铜、锌的矿物共生。锌污染是指锌及化合物所引起的环境污染。主要污染源有锌矿开采、冶炼加工、机械制造以及镀锌、仪器仪表、有机会合成和造纸等工业的排放。汽车轮胎磨损以及煤燃烧产生的粉尘、烟尘中均含有锌及化合物，工业废水中锌常以锌的羟基络合物存在。锌是人体含量最多的微量元素，其含量高达3g之多，主要以锌离子的形式参与体内的代谢，参与人体内200多种酶的合成与活化，是机体新陈代谢中必不可少的物质。人体缺锌时会引起一系列的生理现象紊乱，包括组织器官的生理功能异常。如生长发育不良、食欲不振、智力发育差等，同时味觉和视觉也会受影响。但人体摄入锌的量过多时，会造成人体锌中毒，出现呕吐、腹泻，损害肝、肾、血管和心脏功能，甚至造成死亡。相关研究证实机体对锌的摄入量应该适当，机体内的锌在一定浓度时会强化免疫系统，但是当超过一定浓度时则会对机体淋巴细胞有损伤，对机体胸腺和脾脏等免疫器官代谢产生抑制。当锌铜比值过大时易发生高血压和冠心病。锌钼比值过大则预示着癌症晚期。传统的锌检测方法一般可分为冷原子吸收光谱法、石墨碳原子吸收光谱法和火焰原子吸收光谱法等，但是普遍存在灵敏度低、选择性差、易受干扰、价格昂贵的特征。因此迫切需要发展无污染的、简便快速、高灵敏度和高特异性的方法来满足锌检测的需要，以保障食品的安全。
技术实现思路
本专利技术为了解决现有技术中锌的检测普遍存在灵敏度低、选择性差、易受干扰和价格昂贵等，提出一种基于锌的功能核酸的耐高盐比色传感器及其应用。具体技术方案如下：一种基于锌的功能核酸的耐高盐比色传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，其特征在于，所述分子识别元件包括锌离子脱氧核酶；所述锌离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系，所述等温扩增体系包括扩增模板；所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GCTAGAGATTTTCCACACTGATGCAGACGTTGAAGGATTATCTACTAAAAGGGTCTGAGGG；所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：AGATAATCTAGTTGAGCTGTCTGCAT；所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCAACCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCCTCAGACCCTTTTAGTAGATAATCCT；所述信号转换元件包括硫代黄色素。所述等温扩增体系包括A体系和B体系；所述A体系包括：扩增模板、dNTPs和锌离子脱氧核酶切割产物；所述B体系包括：BstDNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液。所述BstDNA聚合酶反应缓冲液：20mMTris-HCl,10mM(NH4)2SO4,50mMKCl,2mMMgSO4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH8.8；所述Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲液：100mMNaCl,50mMTris-HCl,10mMMgCl2,300μg/ml海藻糖，pH7.9。所述传感器在锌离子检测中的应用。本专利技术同时提供一种检测锌离子的方法，包括如下步骤：制备锌离子浓度和G-四链体功能核酸荧光强度关系的标准曲线；按上述制备标准曲线的过程测定待测样品的G-四链体功能核酸荧光强度，通过上述标准曲线计算锌离子的浓度；其中，制备标准曲线的步骤包括：(1)在锌离子脱氧核酶的底物链和酶链中加入不同浓度锌离子溶液，制备锌离子脱氧核酶切割产物；所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GCTAGAGATTTTCCACACTGATGCAGACGTTGAAGGATTATCTACTAAAAGGGTCTGAGGG；所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：AGATAATCTAGTTGAGCTGTCTGCAT；(2)将扩增模板，dNTPs，切割产物和超纯水混合均匀，制备A体系；将BstDNA聚合酶，聚合酶反应缓冲溶液，Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶的反应缓冲溶液混合均匀，制备B体系；所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCAACCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCCTCAGACCCTTTTAGTAGATAATCCT；(3)A体系先进行孵育，然后与B体系迅速进行混合，孵育扩增，终止反应后得到扩增产物；(4)将扩增产物、硫代黄色素原液、显色缓冲液与超纯水混匀并反应，形成G-四链体结构；(5)测定步骤(4)的反应混合液的荧光强度，得到荧光强度随锌离子浓度变化的标准曲线。步骤(1)的操作为：将脱氧核酶底物链和酶链用缓冲液稀释，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃；加入待测锌离子溶液，25℃孵育6min，加入终止液，得到切割产物。步骤(3)的操作为：A体系于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应。步骤(4)中反应温度为25℃，反应时间为20min。本专利技术还提供了一种检测锌离子的试剂盒，包括锌离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显示体系；所述锌离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、缓冲液、锌离子标准溶液和终止液；所述等温扩增体系包括扩增模板、dNTPs、超纯水、BstDNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；所述显示体系包括：硫代黄色素原液和显示缓冲液；所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GCTAGAGATTTTCCACACTGATGCAGACGTTGAAGGATTATCTACTAAAAGGGTCTGAGGG；所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：AGATAATCTAGTTGAGCTGTCTGCAT；所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCAACCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCCTCAGACCCTTTTAGTAGATAATCCT。所述缓冲液为终浓度50mMHEPES-NaClpH7.0；所述终止液为浓度0.2MEDTA，2MNaCl，0.5MTris；所述显色缓冲液的配方为：50mMTris-HCl，50mMKCl，pH7.2；所述硫代黄色素原液由0.1mol硫代黄色素干粉与1mL显色缓冲液混合得到。本专利技术还提供一种锌离子脱氧核酶，所述锌离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GCTAGAGATTTTCCACACTGATGCAGACGTTGAAGGATTATCTACTAAAAGGGTCTGAGGG；所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：AGATAATCTAGTTGAGCTGTCTGCAT。本专利技术的有益效果为：1、本专利技术基于锌离子脱氧核酶由底物链与酶链两条寡核苷酸链组成，形成特定的二级结构；痕量锌离子能够特异性识别锌离子脱氧核酶，结合脱氧核酶的酶链，并激活脱氧核酶，切割脱氧核酶的底物链，产生切割产物；有且只有切割产物存在时，促发等温指数放大反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于锌的功能核酸的耐高盐比色传感器，其特征在于，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，其特征在于，所述分子识别元件包括锌离子脱氧核酶；所述锌离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系，所述等温扩增体系包括扩增模板；所述脱氧核酶底物链的序列(5’‑3’)为：GCTAGAGATTTTCCACACTGATGCAGACGTTGAAGGATTATCTACTAAAAGGGTCTGAGGG；所述脱氧核酶酶链的序列(5’‑3’)为：AGATAATCTAGTTGAGCTGTCTGCAT；所述扩增模板的序列(5’‑3’)为：CCCAACCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCCTCAGACCCTTTTAGTAGATAATCCT；所述信号转换元件包括硫代黄色素。

【技术特征摘要】
1.一种基于锌的功能核酸的耐高盐比色传感器，其特征在于，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，其特征在于，所述分子识别元件包括锌离子脱氧核酶；所述锌离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系，所述等温扩增体系包括扩增模板；所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GCTAGAGATTTTCCACACTGATGCAGACGTTGAAGGATTATCTACTAAAAGGGTCTGAGGG；所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：AGATAATCTAGTTGAGCTGTCTGCAT；所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCAACCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCCTCAGACCCTTTTAGTAGATAATCCT；所述信号转换元件包括硫代黄色素。2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述等温扩增体系包括A体系和B体系；所述A体系包括：扩增模板、dNTPs和锌离子脱氧核酶切割产物；所述B体系包括：BstDNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液。3.权利要求1或2所述传感器在锌离子检测中的应用。4.一种检测锌离子的方法，其特征在于，包括如下步骤：制备锌离子浓度和G-四链体功能核酸荧光强度关系的标准曲线；按上述制备标准曲线的过程测定待测样品的G-四链体功能核酸荧光强度值，通过上述标准曲线计算锌离子的浓度；其中，制备标准曲线的步骤包括：(1)在锌离子脱氧核酶的底物链和酶链中加入不同浓度锌离子溶液，制备锌离子脱氧核酶切割产物；所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：GCTAGAGATTTTCCACACTGATGCAGACGTTGAAGGATTATCTACTAAAAGGGTCTGAGGG；所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：AGATAATCTAGTTGAGCTGTCTGCAT；(2)将扩增模板，dNTPs，切割产物和超纯水混合均匀，制备A体系；将BstDNA聚合酶，聚合酶反应缓冲溶液，Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶的反应缓冲溶液混合均匀，制备B体系；所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCAACCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCCTCAGACCCTTTTAGTAGATAATCCT；(3)A体系先进行孵育，然后与B体系迅速进行混合，孵育扩增，终止反应后得到扩增产物；(4)将扩增产物、硫...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗云波，许文涛，黄昆仑，田晶晶，肖冰，杜再慧，董凯，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11