一种纯合转基因油菜的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种纯合转基因油菜的制备方法，其制备过程包括下述步骤：供体油菜的选择；花序浸染法浸染供体油菜；双单倍体诱导系技术对供体油菜进行后代诱导纯合；种子收集；纯合转基因油菜筛选。通过花序浸染法对供体浸染，将目标转基因转到供体的雌配子中，再利用双单倍体诱导系技术，诱导供体油菜雌配子的染色体组自发加倍，从而获得纯合的转基因双单倍体，省去了耗时的自交时间，避免了组织培养及化学加倍等环节，大大加快了育种进程。

【技术实现步骤摘要】
一种纯合转基因油菜的制备方法
本专利技术涉及转基因品种领域，尤其涉及一种纯合转基因油菜的制备方法。
技术介绍
目前获得纯合转基因油菜主要有两种途径，一是直接以二倍体油菜为对象，对种子或愈伤组织进行农杆菌侵染转基因，之后对转基因第一代植株进行自交，收获转基因第二代植株，进而不断筛选出纯合转基因植株；二是先通过小孢子培养技术获得单倍体油菜，再对单倍体植株进行转基因，之后通过秋水仙素等化学加倍法对单倍体进行染色体加倍即通过人工染色体加倍，从而获得纯合的转基因植株(如图1所示)。第一种方法耗费大量的时间，至少需要2个世代才能获得目标植株，有些甚至需要多自交几个世代才能获得目标转基因的纯合后代，第二种方法首先需要得到单倍体，而小孢子培养技术操作复杂、费时费力，且成功率较低，秋水仙素等加倍剂毒性大且容易导致嵌合体的产生。因而，现有的获得转基因纯合后代普遍存在的问题是：方法操作繁琐，不能够一步到位。主要原因有：转基因对象多为杂合二倍体，转入的基因常为单拷贝且为杂合状态，需要至少经过1个世代的自交才能得到纯合转基因后代，且自交得到纯合转基因植株的效率不能达100％，想要得到数量较多的目标转基因个体则至少还需要增加一个生育期，这就导致了试验效率大大降低。或者，小孢子培养操作复杂，单倍体获得率低，染色体加倍剂毒性大，化学加倍率不高，容易得到倍性嵌合体。因此，急需提供一种新的操作简便、周期短、诱导率高，毒性低的纯合转基因油菜的制备方法，以解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种制备纯合转基因油菜的方法，其制备操作简便、周期短、诱导率高。为实现上述目的，本专利技术提供了一种纯合转基因油菜的制备方法，其制备过程包括下述步骤：供体油菜的选择；花序浸染法浸染供体油菜；双单倍体诱导系技术对供体油菜进行后代诱导纯合；种子收集；转基因油菜筛选。本专利技术通过花序浸染法对供体浸染，将目标转基因转到供体的雌配子中(即仅含有卵细胞)而非易产生不育的雄配子或受精后的合子中，再利用双单倍体诱导系技术，通过受精后诱导系染色体组丢失和母本雌配子染色体组自发加倍，从而获得纯合的双单倍体，即将转基因和基因纯合紧密联系在一起，通过双单倍体诱导系的刺激，使被转基因的母本雌配子基因组发生自发加倍，省去了耗时的自交时间，避免了组织培养及化学加倍等环节，大大加快了育种进程，并通过一系列的转基因油菜筛选步骤确保转基因后代的纯合性和血统的纯正。进一步的，供体油菜的选择步骤包括选择初花期前的油菜。选择健壮植株上的主花序和第一次分株，选择3-5天后即将开放的花蕾，此发育时期的油菜浸染转化成功率较高，因为大量研究表明农杆菌是在心皮闭合之前进入子房室的。进一步的，所述花序浸染法浸染供体油菜步骤包括将供体油菜的花序浸染在农杆菌菌液中。具体为将油菜花序浸染在农杆菌菌液中2～5min，套袋保持24小时的避光，连续浸染3～4次，每次间隔24小时。根据油菜花序发育情况，在农杆菌浸染前后进行去雄处理，用人工去雄或者机械化去雄仅留有雌蕊油菜进行后续花粉授粉。进一步的，所述双单倍体诱导系技术对供体油菜进行后代诱导纯合步骤包括收集双单倍体诱导系的油菜花粉，将油菜花粉涂抹在所述花序浸染法浸染供体油菜的柱头上，并进行套袋处理。具体为收集双单倍体诱导系的油菜花粉，将油菜花粉涂抹在所述花序浸染法浸染供体油菜的柱头上，授粉后套袋处理，防止与其他花粉交叉污染。重复授粉3～4次，以保证诱导充分获得纯合双单倍体。待花期结束后，去掉花粉纸袋。双单倍体诱导系技术可采用八倍体供体给四倍体授粉、四倍体对二倍体授粉、二倍体对单倍体授粉，优选为八倍体对四倍体授粉，其能得到只含有母本基因组的纯合后代。油菜种类包括甘蓝型油菜，白菜型油菜和芥菜型油菜，优选采用甘蓝型油菜作为授粉对象，因为甘蓝型油菜的花序中间花蕾着生位置高于开放花朵，开花时花药一般内向开裂或半内向开裂，在进行花序浸染时，比较容易将目标转基因转到供体的雌配子中而非易产生不育的雄配子或受精后的合子中，同时甘蓝型油菜自交亲和性强，自交结实率高，更加激发了双单倍体诱导系效果，大大加快了育种进程。进一步的，所述转基因油菜筛选步骤包括抗生素鉴定、PCR鉴定、倍性鉴定、分子纯合性鉴定而进行油菜植株筛选。所述抗生素鉴定步骤包括将收集到的种子播种于抗生素培养基中，通过光照培养筛选出正常的油菜植株，具体的为将收获的种子播种于抗生素培养基中，在室温下光照10～20小时/天，观察植株的抗药性从而筛选出长势正常的油菜植株。所述PCR鉴定步骤包括采用CTAB法提取植株的DNA，设计引物，进行PCR检测，筛选出阳性的油菜植株。所述倍性鉴定步骤包括利用流式细胞仪分析油菜植株的倍性，筛选出正常倍性的油菜植株，具体的为采用流式细胞仪技术对经过PCR鉴定出的阳性转基因植株进行细胞倍性鉴定，筛选出正常倍性的油菜植株。进一步的，所述PCR鉴定步骤之后还包括表型鉴定步骤，将阳性的油菜植株进行抗生素或病菌接种处理，筛选出具有良好抗药性且正常的油菜植株。所述分子纯合性鉴定步骤包括将第一代植株进行自交得到第二代植株，对所述第二代植株进行多种性状鉴定，通过观察性状分离现象推测转基因第一代植株的分子纯合性。所述性状鉴定包括抗生素鉴定、表型鉴定、病菌接种鉴定的一种或几种。所述抗生素鉴定和表型鉴定同前述第一代植株的抗生物鉴定和表型鉴定。所述病菌接种鉴定为通过对第二代植株进行病菌接种，通过观察第二代植株是否存在性状分离现象以推测第一代植株的分子纯合性。本专利技术提供的一种纯合转基因油菜的制备方法，通过花序浸染法和双单倍体诱导系技术的结合，诱导转基因雌配子的染色体组自发加倍，从而获得纯合双单倍体，大大加快育种进程并通过一系列的转基因油菜筛选步骤确保转基因后代的纯合性和血统的纯正。附图说明图1为现有技术采用秋水仙素处理获得转基因植株的制备过程示意图。图2为本专利技术采用花序浸染和双单倍体系诱导技术获得转基因植株的制备过程示意图。具体实施方式下面通过具体实施方式来进一步说明本专利技术的技术方案，但不构成对本专利技术的任何限制。实验材料：农杆菌菌株LBA4404(质粒为含有bar基因的pCAMBIA1300-bar，北京鼎国昌盛生物技术公司)；农杆菌菌株EHA105(Biovector公司)；大肠杆菌菌株DH5(Biovector公司)；草铵膦(拜耳作物科学公司)；除草剂Basta(拜耳作物科学公司)转化甘蓝型油菜“3108”和“3221”(成都市农林科学院)；质粒P1Y46(载体为pZP211-RPW8.1，含有外源基因RPW8.1)；RPW8基因(高亢白粉病的拟南芥中克隆而来)；转化甘蓝型油菜材料“ZX09”(成都市农林科学院)实施例11.1农杆菌悬浮液制备1.1.1农杆菌感受态的制备取新鲜的农杆菌株LBA4404到LB固体培养基上活化，28℃培养36h后，挑取单菌落接种于10ml的LB液体培养基中，28℃条件下200r/min摇菌，培养至OD值为0.5-0.6。将培养好的菌液经过冰浴-离心-加入NaCl两次循环后，加入甘油混匀，在-80℃冰箱中保存备用。1.1.2冻融法转化农杆菌取感受态农杆菌LBA4404解冻，加入质粒pCAMBIA1300-bar，冰浴后迅速取出，在液氮中冷冻，再水浴加入已灭菌的LB液体培养基，震荡培养3-4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯合转基因油菜的制备方法，其特征在于，其制备过程包括下述步骤：供体油菜的选择；花序浸染法浸染供体油菜；双单倍体诱导系技术对供体油菜进行后代诱导纯合；种子收集；转基因油菜筛选。

【技术特征摘要】
1.一种纯合转基因油菜的制备方法，其特征在于，其制备过程包括下述步骤：供体油菜的选择；花序浸染法浸染供体油菜；双单倍体诱导系技术对供体油菜进行后代诱导纯合；种子收集；转基因油菜筛选。2.根据权利要求1所述的一种纯合转基因油菜的制备方法，其特征在于，所述供体油菜的选择步骤包括选择初花期前的油菜。3.根据权利要求1所述的一种纯合转基因油菜的制备方法，其特征在于，所述花序浸染法浸染供体油菜步骤包括将供体油菜的花序浸染在具有目标转基因的农杆菌菌液中。4.根据权利要求1所述的一种纯合转基因油菜的制备方法，其特征在于，所述双单倍体诱导系技术对供体油菜进行后代诱导纯合步骤包括收集双单倍体诱导系的油菜花粉，将油菜花粉涂抹在所述花序浸染法浸染供体油菜的柱头上，并进行套袋处理。5.根据权利要求1所述的一种纯合转基因油菜的制备方法，其特征在于，所述转基因油菜筛选步骤包括抗生素鉴定、PCR鉴定、倍性鉴定、分子纯合性鉴定而进行油菜植株筛选。6.根据权利要求5所述的一种纯合...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷丽琴，付绍红，杨进，李云，王继胜，李兰，
申请(专利权)人：成都市农林科学院，
类型：发明
国别省市：四川,51