一种水稻OsFLRs基因及其应用制造技术

一种水稻Os

【技术实现步骤摘要】
一种水稻OsFLRs基因及其应用
本专利技术涉及一种水稻种植调控基因，尤其是涉及一种水稻OsFLRs基因及其应用，尤其是在水稻稻米粒形、营养品质上的应用。
技术介绍
水稻稻米粒形及营养品质是评价优质水稻的重要指标，粒形主要受到稻米品种遗传基因的调控，它是商品稻米定价、分类的主要依据，且对稻米最终的品质也有重要的影响。稻米的营养品质对稻米的品质起决定性的作用，稻米中的主要成分淀粉分为直链淀粉和支链淀粉，二者的比例一直被认为是影响蒸煮品质和食味品质的主要因素。有研究发现，直链淀粉高的米饭，米饭硬、饭粒干燥而蓬松、米饭黏度较低、色泽较暗。而反之，米饭软、黏度大、饭粒光泽度也较好。而直链淀粉和支链淀粉的含量也能通过基因水平调节，因此，通过基因改良水稻品质是一种策略。CrRLK1是一种植物特有的类受体蛋白激酶，其最早发现于长春花属植物，而FERONIA（FER）是其中的一类家族成员，目前在拟南芥中的研究发现，其在双子叶植物中作为RALF（快速碱化因子）的受体，能够调控种子的大小，此外其作为激素的交叉会话节点，起到对促进细胞伸长的油菜素类酯与生长素起促进作用，而对抑制细胞伸长的乙烯和脱落酸起到抑制作用。目前，并没有关于水稻基因FLRs在水稻调控稻米粒形和营养品质应用的报道。而在单子叶植物水稻中CrRLK1-L家族有20个成员，其中三个成员（Os03g03290，Os05925430，Os04g49690）激酶域缺失。因此，采用生物技术手段改变水稻中CrRLK1-L家族中基因的表达水平，进而改善水稻稻米的粒形和营养品质，具有显著的意义和较广的应用空间。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：寻找与水稻稻米粒形、营养品质调控相关的功能基因，进而提供一种可改善稻米粒形和营养品质的水稻OsFLRs基因，以及该基因编码的水稻OsFLRs功能蛋白，以及该水稻OsFLRs基因在稻米粒形、营养品质上的应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：本专利技术之一种水稻OsFLRs基因，由核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的OsFLR1和OsFLR2基因组成，OsFLR1和OsFLR2基因分别是水稻CrRLK1-L家族中的Os03g21540和Os01g56330。本专利技术之一种水稻OsFLRs功能蛋白，由OsFLR1和OsFLR2基因编码获得，其氨基酸酸序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示。本专利技术之一种水稻OsFLRs基因的过表达载体，所示载体含有35S强启动子。本专利技术之一种水稻OsFLRs基因在水稻中的应用可能性分析方法，通过三引物法对flr1及flr2突变体进行鉴定，并获得flr1和flr2纯合的突变体，并对其mRNA水平进行鉴定。进一步，flr1、flr2T-DNA鉴定引物名称如下：FLR1-LP：5’-gcaggtggatgctggttatc-3’FLR1-RP：5’-atcgaggaggatgtttgtcg-3’FLR2-LP：5’-gccatgttcttcaattcctgtcc-3’FLR2-RP：5’-ggagcaagagcacgaatctgg-3’RB1：5’-ttggggtttctacaggacgtaac-3’本专利技术之一种水稻OsFLRs基因在水稻中的应用，包括水稻OsFLRs基因在调控稻米粒形和稻米营养品质的应用。本专利技术之一种水稻OsFLRs基因在水稻中的应用，其具体操作包括：水稻OsFLRs基因（包括OsFLR1和OsFLR2基因）的克隆，构建水稻OsFLRs基因的过表达载体并转化入农杆菌菌株，再将农杆菌侵染水稻愈伤组织后筛选获得35S::FLR1和35S::FLR2过表达株系。水稻OsFLRs基因（包括OsFLR1和OsFLR2基因）的克隆1）FLR1及FLR2引物设计：从NCBI中获得水稻FLR1和FLR2基因的编码序列，分别以FLR1及FLR2的全长编码序列为模板进行引物设计，在FLR1、FLR2的上游引物F1的5’端加入KpnI限制性内切酶酶切位点和保护碱基；在FLR1，FLR2的下游引物R1的5’端加入XbalI限制性内切酶酶切位点和保护碱基。FLR1-F：5'-GGGGTACCATGGTGAGTTCTAGGTTTGTGGCCG-3'；FLR1-R：5'-GCTCTAGACCGTCCCTTGGGGTTCATG-3'；FLR2-F：5'-GGGGTACCATGGGAAGCTCCAGATTCGTGC-3'；FLR2-R:5'-GCTCTAGACCGTCCCTTGGGGTTCATG-3'；其中，GGTACC为KpnI酶切位点，TCTAGA为XbalI酶切位点；2）PCR克隆：PCR反应扩增OsFLR1和OsFLR2基因片段，PCR反应体系（20μL），PCR反应条件：98℃预变性5min；98℃变性15s，60℃退火15s，68℃延伸140s，32个循环后，72℃继续延伸10min，在72℃延伸10min前加入普通Taq酶，完成后在4℃保存。3）PCR产物鉴定：将OsFLR1、OsFLR2的PCR产物胶回收，与pMD18-T载体连接，转化感受态大肠杆菌Top10，涂Amp抗生素的平板，采用菌落PCR进行初步筛选后，将阳性克隆送往博尚测序公司进行测序及BLAST分析，构建水稻OsFLRs基因的过表达载体并转化农杆菌菌株：4）重组35S::FLR1-pCAMBIA1300、35S::FLR2-pCAMBIA1300载体的构建：将阳性质粒pMD18-T-FLR1和pMD18-T-FLR2经XbalI和KpnI双酶切后回收，与同样经XbalI和KpnI双酶切回收后的pCAMBIA1300混合，加入T4连接酶及连接缓冲液buffer，连接过夜后，转化感受态大肠杆菌Top10，涂LB平板（含有50mg/LKan），37℃过夜培养后，即可以进行获得单菌落，进行菌落PCR鉴定可以获得35S::FLR1-pCAMBIA1300和35S::FLR2-pCAMBIA1300。5)获得35S::FLR1-pCAMBIA1300及35S::FLR2-pCAMBIA1300的农杆菌菌株：将35S::FLR1-pCAMBIA1300及35S::FLR2-pCAMBIA1300的阳性克隆质粒转化入Ag10感受态细胞，涂布LB平板(含有50mg/LKan、50mg/LRif)培养，28℃倒置培养2d，形成单菌落，并利用菌落PCR筛选出携带目的基因的农杆菌。侵染水稻获得35S::FLR1和35S::FLR2过表达株系及其应用结果检测6)35S::FLR1-pCAMBIA1300和35S::FLR2-pCAMBIA1300转基因植株的获得：将含有35S::FLR1-pCAMBIA1300和35S::FLR2-pCAMBIA1300重组载体的农杆菌转入水稻愈伤组织，通过筛选、分化、生根后得到阳性的过表达植株，并通过PCR鉴定植株的真实性。7)过表达植物稻米粒形及营养品质的测定：通过收获过表达植株的种子，将抗生素进一步筛选萌发后得到纯合株系，进一步收获后得到35S::FLR1-pCAMBIA1300和35S::FLR2-pCAMBIA1300过表达稻米种子，再参考国家标准测定过表达株系与相应野生型对照的稻本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻Os

【技术特征摘要】
1.一种水稻OsFLRs基因，其特征在于，由核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的OsFLR1和OsFLR2基因组成。2.一种水稻OsFLRs功能蛋白，由OsFLR1和OsFLR2基因编码获得，其氨基酸酸序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示。3.一种水稻OsFLRs基因的过表达载体，所示载体含有35S强启动子。4.一种水稻OsFLRs基因在水稻中的应用可能性分析方法，通过三引物法对flr1及flr2突变体进行鉴定，并获得flr1和flr2纯合的突变体，并对其mRNA水平进行鉴定。5.如权利要求4所述水稻OsFLRs基因在水稻中的应用可能性分析方法，其特征在于，所述flr1、flr2T-DNA鉴定引物名称如下：FLR1-LP：5’-gcaggtggatgctggttatc-3’；FLR1-RP：5’-atcgaggaggatgtttgtcg-3’；FLR2-LP：5’-gccatgttcttcaattcctgtcc-3’；FLR2-RP：5’-ggagcaagagcacgaatctgg-3’；RB1：5’-ttggggtttctacaggacgtaac-3’。6.一种水稻OsFLRs基因在水稻中的应用，包括水稻OsFLRs基因在调控稻米粒形和稻米营养品质上的应用。7.如权利要求6所述一种水稻OsFLRs基因在水稻中的应用，其特征在于，其具体操作包括：OsFLR1和OsFLR2基因的克隆；构建水稻OsF...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪龙，林亲录，于峰，杨涛，李驰宇，刘选明，
申请(专利权)人：中南林业科技大学，湖南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43