盐酸苄丝肼在制备PCSK9抑制剂中的应用制造技术

本发明专利技术涉及盐酸苄丝肼在制备PCSK9抑制剂中的应用，属于生物医药技术领域。本发明专利技术通过HepG2细胞模型研究了盐酸苄丝肼对于PCSK9的抑制作用，结果显示盐酸苄丝肼对于LDL孵育的HepG2细胞模型的PCSK9表达具有显著的抑制作用，并且能够显著提升了LDLR的表达。具体是通过LDL孵育HepG2细胞构建高脂血模型，给予不同浓度的盐酸苄丝肼，结果发现盐酸苄丝肼能够显著降低HepG2细胞PCSK9的基因和蛋白水平表达，同时显著提升了LDLR的基因和蛋白水平的表达。将盐酸苄丝肼通过添加药学上可接受的载体制备成临床需要的各种制剂，其有益效果是：为制备PCSK9抑制剂提供新的途径。

The application of chloric acid in the preparation of PCSK9 inhibitors

The invention relates to the application of the preparation of PCSK9 inhibitor in the field of biomedicine. In this study, the inhibition of PCSK9 was studied by HepG2 cell model. The results showed that the expression of PCSK9 in the HepG2 cell model incubated by LDL was significantly inhibited and the expression of LDLR was significantly enhanced. Specifically, HepG2 cells were incubated by LDL to construct a high fat blood model and give different concentrations of HCl. The results showed that the gene and protein level of PCSK9 in HepG2 cells could be significantly reduced, and the expression of LDLR gene and protein level was significantly increased. A variety of preparations are prepared by adding a pharmaceutical acceptable carrier, which is beneficial to provide a new way for the preparation of PCSK9 inhibitors.

【技术实现步骤摘要】
盐酸苄丝肼在制备PCSK9抑制剂中的应用
本专利技术涉及盐酸苄丝肼在制备PCSK9抑制剂中的应用，属于生物医药

技术介绍
动脉粥样硬化(AS)是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因。脂质代谢障碍是动脉粥样硬化的病变基础，其中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)是致动脉粥样硬化心血管疾病最重要的危险因素，有研究者提出，降低LDL-C应作为治疗AS的主要目标。血浆中LDL-C主要经LDL受体(LDLR)内化代谢，在肝脏转化成胆汁酸或直接经胆管排出，是体内清除血浆LDL-C的最主要的去路.临床针对血脂异常的防治除饮食治疗和改善生活方式之外，还采用药物进行调脂治疗。他汀通过竞争性抑制细胞内胆固醇合成，已成为降血脂的首选药物。研究表明，他汀类通过调节LDLR表达增高，降低血浆LDL-C水平，但同时也升高了介导LDLR溶酶体降解作用的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9型(PCSK9)的表达，使他汀类药物单用大剂量降脂作用受限，寻求以PCSK9为作用靶点的药物，将为进一步增强联合用他汀降低血脂药物开发提供理论依据。盐酸苄丝肼为白色或类白色结晶粉末，易溶于水，微溶于乙醇，其性质极不稳定，对溶剂、PH、光线、温度以及湿度的变化极为敏感。盐酸苄丝肼是一种外周脱羧酶抑制剂，常与左旋多巴联合制成复合制剂多巴丝肼用于帕金森病的治疗。但是目前还没有关于盐酸苄丝肼可以制备PCSK9抑制剂的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供盐酸苄丝肼在制备PCSK9抑制剂中的应用。本专利技术通过HepG2细胞模型研究了盐酸苄丝肼对于PCSK9的抑制作用，结果显示盐酸苄丝肼对于LDL孵育的HepG2细胞模型的PCSK9表达具有显著的抑制作用，并且能够显著提升了LDLR的表达。具体是通过LDL孵育HepG2细胞构建高脂血模型，给予不同浓度的盐酸苄丝肼，结果发现盐酸苄丝肼能够显著降低HepG2细胞PCSK9的基因和蛋白水平表达，同时显著提升了LDLR的基因和蛋白水平的表达。将盐酸苄丝肼通过添加药学上可接受的载体制备成临床需要的各种制剂，其有益效果是：为制备PCSK9抑制剂提供新的途径。附图说明图1为HepG2细胞各实验组PCSK9westernblting蛋白条带结果图。图2为HepG2细胞各实验组PCSK9westernblting数据统计分析结果图。图3为HepG2细胞各实验组PCSK9QPCR结果图。图4为HepG2细胞各实验组LDLRwesternblting蛋白条带结果图。图5为HepG2细胞各实验组LDLRwesternblting数据统计分析结果图。图6为HepG2细胞各实验组LDLRQPCR结果图。图7为盐酸苄丝肼对HepG2细胞毒性实验结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受实施例的限制。实施例建立HepG2细胞高脂血症模型并给药HepG2细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。1-2d换液，待细胞长满后，0.25％胰酶消化，1∶3传代。将细胞分为control组、LDL组、BH-10-8组、BH-10-9组、BH-10-10组。将细胞以5×106个/孔铺在六孔板内，24h后，除空白组外其余各组给予100μg/mLLDL孵育24h。之后BH-10-8组、BH-10-9组和BH-10-10组分别给予10-8、10-9、10-10M盐酸苄丝肼孵育24h。提取细胞蛋白并做westernbloting实验收集细胞，冰0.01MPBS清洗细胞两次。每管细胞150μLRIPA细胞裂解液，使裂解液和细胞充分接触，置于冰上裂解30min。4℃12000rpm离心10min，取上清液，即为提取的总蛋白。利用BCA试剂盒检测各组蛋白浓度。取总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，200mA，2h电转至PVDF膜上，5％脱脂牛奶室温下封闭2h，加入一抗4℃孵育过夜。TBST洗涤10min×3次。二抗标记室温孵育1.5h，TBST洗涤10min×3次。将PVDF膜置于ECL化学发光仪中，取等体积的ECL试剂A和ECL试剂B混合，混匀后加在膜表面，避光显色，Bio-Rad成像系统拍照。灰度分析后，处理数据，结果如图1、2、4、5。提取细胞mRNA并做QPCR实验收集细胞，冰0.01MPBS清洗细胞两次。每管细胞加入1mLTrizol，室温静置5min。加入200μL氯仿，剧烈振荡30s，室温静置5min，4℃，14000g，15min离心。吸取上层水相至新的EP管。加入等体积的异丙醇，轻柔混匀，颠倒6-8次，静置10min。4℃，14000g，10min离心，收集RNA沉淀。75％冰乙醇洗涤两次，置于超净台风干。加入约20μLDEPC水冰上30min溶解。然后按照逆转录试剂盒惊醒逆转录得到各组CDNA。最后按照SYBRGreen试剂盒进行QPCR，处理数据。结果如图3、6.细胞毒性检测将HepG2细胞，0.25％胰酶消化，制成细胞悬液，105个/孔铺板，每孔100μL，培养24h。除空白组，其余各组分别加入10-4至10-11mol/L的盐酸苄丝肼溶液，培养24h。每孔加入20μLMTT，继续培养4h。弃去上清液，每孔加入150μL二甲亚砜，震荡10min，在酶标仪0D490下检测吸光度，进行数据分析。结果如图7。除上述实施外，本专利技术还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本专利技术要求的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
盐酸苄丝肼在制备PCSK9抑制剂中的用途。

【技术特征摘要】
1.盐酸苄丝肼在制备PCSK9抑制剂中的用途。2.根据权利要求1所述盐酸苄丝肼在制备PCSK9抑制剂中的用途，其特征在于：所述盐酸苄丝肼通过添加药学上可接受...

【专利技术属性】
技术研发人员：何书英，王绍达，吕杭音，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32