羊副结核分支杆菌的LAMP检测引物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法技术

一种羊副结核分支杆菌的LAMP检测引物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法，检测引物包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF。试剂盒包括Tris·HCl，KCl，(NH4)2SO4，Tween20，甜菜碱，MgSO4，dNTP each，Bst DNA polymerase，钙黄绿素指示剂，LAMP检测引物。利用LAMP试剂盒进行LAMP；观察LAMP反应溶液颜色变化，绿色表示检测为阳性，橙色表示检测为阴性。优点是：具有简便、快速、准确、廉价、可视等优点，可用于畜牧业生产单位筛查和检测羊副结核分支杆菌，对羊副结核病的净化与控制具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
羊副结核分支杆菌的LAMP检测引物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种羊副结核分支杆菌的LAMP检测引物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。
技术介绍
副结核病(Paratuberculosis)也叫副结核性肠炎，是由副结核分支杆菌(Mycobacteriumparatuberculosis)引起反刍兽的一种慢性传染病，主要侵害牛羊，骆驼、马、鹿等也可感染，发病特点是慢性卡他性肠炎、顽固性腹泻、逐渐消瘦、肠黏膜增厚并形成皱褶，最后以肠紊乱或易感染其他病症而导致动物死亡。本病在全世界范围内流行，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的动物疫病，我国将该病定为二类动物疫病。特别是舍饲羊副结核发病率有明显上升趋势，给养羊业造成了巨大的经济损失。另外，该病尚无有效的治疗方法，最好的控制方法就是对畜群进行严格的检疫并及时淘汰阳性羊。为此，开展羊副结核分支杆菌的检测方法研究具有重要意义。目前，用于羊副结核病检测的方法很多，如琼脂扩散试验、皮内变态反应、补体结合反应和酶联免疫吸附试验等检测方法，但这些方法主要是检测抗体，而不能检测副结核分支杆菌。虽然基于PCR技术的检测方法也已建立，但PCR需要昂贵的仪器，而且操作繁琐。为此，急需建立一种敏感、准确、快速、简便的羊副结核分支杆菌检测方法。环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi等人专利技术的新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。近年来，国内外已将该技术广泛应用于病原体检测。非盈利的国际创新新诊断技术基金会(FIND)和与日本荣研化学株式会社利用LAMP技术建立了肺结核快速检测系统；MasakiImai等人利用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；LAMP还可以检测其它与动物相关的细菌，如侵入性大肠杆菌、沙门氏杆菌、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、单核细胞增生性李斯特菌、猪肺炎支原体等。但是迄今为止，用于检测羊副结核分支杆菌的LAMP引物与试剂盒在国内外均未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种特异性强、灵敏度高、检测快速方便的羊副结核分支杆菌的LAMP检测引物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。本专利技术的技术解决方案是：一种羊副结核分支杆菌的LAMP检测引物，包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF，各引物序列具体如下：F3：5′-CCTAGACTCGCGGACTCTT-3′；B3：5′-CACGGGTCACGTAGAAACG-3′；FIP：5′-CGGGCATCGAAGATCGCTACCAATTGTGACGTACGGGCTAC-3′；BIP：5′-TGGTCGATATCGGAGCTCCTCTGTTCCATCGACAGCTCAGC-3′；LF：5′-CGAATGCGTTCTGCCCCA-3′。上述LAMP检测引物在羊副结核分支杆菌的中的应用。一种羊副结核分支杆菌的LAMP检测试剂盒，包含23μL检测溶液，所述的检测溶液包括：20mMTris·HCl、pH为8.8，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mMMgSO4，1.4mMdNTPeach，8UBstDNApolymerase，钙黄绿素指示剂1μL，引物加入量为：5pmol正向外引物F3和5pmol反向外引物B3，40pmol正向内引物FIP和40pmol反向内引物BIP，5pmol正向环引物LF，最后用ddH2O补足至23μL；其中各引物具体序列如下：F3：5′-CCTAGACTCGCGGACTCTT-3′；B3：5′-CACGGGTCACGTAGAAACG-3′；FIP：5′-CGGGCATCGAAGATCGCTACCAATTGTGACGTACGGGCTAC-3′；BIP：5′-TGGTCGATATCGGAGCTCCTCTGTTCCATCGACAGCTCAGC-3′；LF：5′-CGAATGCGTTCTGCCCCA-3′。进一步的，所述钙黄绿素指示剂1μL包含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰。上述LAMP检测试剂盒在羊副结核分支杆菌的中的应用。进一步的，包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用LAMP试剂盒进行LAMP；观察LAMP反应溶液颜色变化，绿色表示检测为阳性，存在羊副结核分支杆菌，橙色表示检测为阴性，不存在羊副结核分支杆菌。进一步的，提取待检微生物的DNA，取2μLDNA溶液，加入23μLLAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP，LAMP反应程序为：60℃～65℃，45min～55min，扩增产物进行颜色变化的观察。进一步的，LAMP扩增条件为：63℃恒温50min。本专利技术提供了一种羊副结核分支杆菌的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。本专利技术的有益效果：1)高特异性：5条引物对羊副结核分支杆菌靶序列的6个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增；2)高灵敏度：灵敏度比普通PCR高100倍；3)结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果(钙黄绿素显色)，也可以用电泳LAMP产物判断结果；4)操作简单：只要将检测样品(靶核酸)和检测试剂一起放入60-65℃恒温水浴锅中50分钟后就可以判断结果；5)快速、高效扩增：整个LAMP扩增反应一小时内即可完成，且检测下限可达1.02×102拷贝/μL，检测灵敏度高。综上所述，本专利技术可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到羊副结核分支杆菌，不需要复杂仪器，为羊副结核分支杆菌的检测提供了一个新的技术平台，可用于畜牧业生产单位筛查和检测羊副结核分支杆菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。附图说明图1为4套引物组合的LAMP扩增电泳图；图中：1，DL2000DNAMarker；2，阳性对照；3，阴性对照；4，MP1(阳性模板)；5，MP1(阴性模板)；6，MP2(阳性模板)；7，MP2(阴性模板)；8，MP3(阳性模板)；9，MP3(阴性模板)；10，MP4(阳性模板)；11，MP4(阴性模板)；2％琼脂糖凝胶，上样量0.5μl；图2为实施例1设计的4套引物组合LAMP扩增的钙黄绿素指示剂染色结果；图中：1，MP1(阳性模板)；2，MP1(阴性模板)；3，MP2(阳性模板)；4，MP2(阴性模板)；5，MP3(阳性模板)；6，MP3(阴性模板)；7，MP4(阳性模板)；8，MP4(阴性模板)；9，阳性对照；10，阴性对照；自然光下拍摄；图3为本专利技术羊副结核分支杆菌LAMP检测方法特异性的电泳检测结果；图中：1，DL2000DNAMarker；2，本地分离菌；3，大肠杆菌；4，沙门氏杆菌；5，链球菌；6，葡萄球菌；7，阴性羊粪便；2％琼脂糖凝胶，上样量0.5μl；图4为本专利技术羊副结核分支杆菌LAMP检测方法特异性的钙黄绿素指示剂染色检测结果；图中：1，DL2000DNAMarker；2，本地分离菌；3，大肠杆菌；4，沙门氏杆菌；5，链球菌；6，葡萄球菌；7，阴性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种羊副结核分支杆菌的LAMP检测引物，包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF，其特征是：各引物序列具体如下：F3：5′‑CCTAGACTCGCGGACTCTT‑3′；B3：5′‑CACGGGTCACGTAGAAACG‑3′；FIP：5′‑CGGGCATCGAAGATCGCTACCAATTGTGACGTACGGGCTAC‑3′；BIP：5′‑TGGTCGATATCGGAGCTCCTCTGTTCCATCGACAGCTCAGC‑3′；LF：5′‑CGAATGCGTTCTGCCCCA‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种羊副结核分支杆菌的LAMP检测引物，包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF，其特征是：各引物序列具体如下：F3：5′-CCTAGACTCGCGGACTCTT-3′；B3：5′-CACGGGTCACGTAGAAACG-3′；FIP：5′-CGGGCATCGAAGATCGCTACCAATTGTGACGTACGGGCTAC-3′；BIP：5′-TGGTCGATATCGGAGCTCCTCTGTTCCATCGACAGCTCAGC-3′；LF：5′-CGAATGCGTTCTGCCCCA-3′。2.如权利要求1所述的LAMP检测引物在羊副结核分支杆菌的中的应用。3.一种羊副结核分支杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征是：包含23μL检测溶液，所述的检测溶液包括：20mMTris·HCl、pH为8.8，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mMMgSO4，1.4mMdNTPeach，8UBstDNApolymerase，钙黄绿素指示剂1μL，引物加入量为：5pmol正向外引物F3和5pmol反向外引物B3，40pmol正向内引物FIP和40pmol反向内引物BIP，5pmol正向环引物LF，最后用ddH2O补足至23μL；其中各引物具体序列如下：F3：5′-CCTAGACTCGCGGACTCTT-3′；B3：5′-CAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：李冰，朱延旭，宋先忱，张兴会，刘孝刚，刘宇明，季伟，
申请(专利权)人：锦州医科大学，辽宁省畜牧科学研究院，
类型：发明
国别省市：辽宁,21