用于检测结核分枝杆菌的组合物和方法技术

描述了用于快速检测结核分枝杆菌(MTB)和MTB‑复合物的其它成员在生物或非生物样品中的存在或不存在的方法。所述方法可以包括执行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外，提供了引物、靶向

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测结核分枝杆菌的组合物和方法
本专利技术涉及细菌诊断的领域，且更具体地涉及结核分枝杆菌（MycobacteriumTuberculosis）的检测。
技术介绍
结核病(TB)是一种由分枝杆菌属的不同菌株（诸如结核分枝杆菌(MTB)和MTB-复合物的其它成员）引起的细菌性疾病，最常见于肺部。当患有肺或喉结核的个体咳嗽、打喷嚏或吐痰并将MTB推进到空气中时，结核病通过空气在人与人之间传播。据估计，世界人口的三分之一被MTB感染，并且每年有9百万人发展成TB。TB一直是人传染性疾病的主要原因，并且MTB的耐药菌株正在增加，尤其是在发展中国家中。用于治疗MTB的两种常用一线药物包括异烟肼(INH)和利福平(RIF)，患者可以通过居住在或访问耐药性普遍的地方而获得耐药MTB。当患者的抗生素治疗方案被中断时，患者也可以发展出耐药MTB。在固体或液体培养基上培养仍然被视为用于MTB和MTB耐药性检测的黄金标准，但是培养可以占用长达八周才能得到结果。因此，本领域需要快速且可靠的方法从而以灵敏的方式特异性地检测MTB。
技术实现思路
本专利技术中的某些实施方案涉及在生物或非生物样品中快速检测MTB的存在或不存在的方法，例如，在单个试管中通过实时聚合酶链式反应对MTB的多路检测。实施方案包括检测MTB的方法，所述方法包括执行至少一个循环步骤，所述循环步骤可以包括扩增步骤和杂交步骤。此外，实施方案包括被设计成在单个试管中检测MTB的引物、探针和试剂盒。将检测方法设计成靶向esxJ基因(和它的同源物基因esxK、esxM、esxP、esxW)，这允许人们在单个测试中检测MTB。在一个实施方案中，提供了一种用于检测样品中的MTB的方法，所述方法包括执行扩增步骤，所述扩增步骤包括使所述样品与esxJ引物组接触，如果MTB存在于所述样品中则产生扩增产物；执行杂交步骤，所述杂交步骤包括使所述扩增产物与一种或多种可检测的esxJ探针接触；和检测所述扩增产物的存在或不存在，其中所述扩增产物的存在指示MTB在所述样品中的存在，且其中所述扩增产物的不存在指示MTB在所述样品中的不存在；其中所述esxJ引物组包含选自以下的序列或由其组成：SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和21或其互补物；且其中所述可检测的esxJ探针包含选自以下的序列或由其组成：SEQIDNO:22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40或其互补物。在一个实施方案中，用于扩增esxJ基因靶标的引物集合包括第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8和9或其互补物的第一寡核苷酸序列，所述第二引物包含选自SEQIDNO:10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和21或其互补物的第二寡核苷酸序列，且用于检测esxJ扩增产物的可检测探针包括SEQIDNO:22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40或其互补物的核酸序列。在所述方法的某些实施方案中，所述杂交步骤包括使所述扩增产物与可检测的esxJ探针接触，所述esxJ探针用供体荧光部分和对应的受体部分标记；且所述检测步骤包括检测所述探针的供体荧光部分和受体部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中所述荧光的存在或不存在指示MTB在所述样品中的存在或不存在。在某些实施方案中，所述扩增步骤采用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。在某些实施方案中，所述供体荧光部分和对应的受体部分是在所述探针上彼此的不超过8-20个核苷酸内。在某些实施方案中，所述受体部分是猝灭剂。在某些实施方案中，第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸中的至少一种包含至少一个修饰的核苷酸。在某些实施方案中，所述第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸。其它实施方案提供了包含选自SEQIDNO:1-40或其互补物的核苷酸序列或由其组成的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种寡核苷酸，其包括与SEQIDNO:1-40之一或其互补物具有至少70%序列同一性(例如，至少75%、80%、85%、90%或95%等)的核酸，所述寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。通常，在这些实施方案中，这些寡核苷酸可以是引物核酸、探针核酸等。在这些实施方案的某些中，所述寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸(例如35个或更少的核苷酸、30个或更少的核苷酸等)。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸，例如以相对于未修饰的核苷酸改变核酸杂交稳定性。任选地，所述寡核苷酸包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包括至少一个保守修饰的变异。特定核酸序列的“保守修饰的变异”或简称的“保守变异”表示这样的核酸：其编码相同的或基本上相同的氨基酸序列，或者，在所述核酸不编码氨基酸序列的情况下，表示基本上相同的序列。技术人员会认识到，改变、添加或删除编码的序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸(通常小于5%，更通常小于4%、2%或1%)的各种置换、缺失或添加是“保守修饰的变异”，其中所述改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加、或化学上类似的氨基酸对氨基酸的置换。在一个方面，扩增可以采用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。因而，所述供体荧光部分和所述受体部分（例如，猝灭剂）可以沿着所述探针的长度在彼此的不超过5-20(例如，8或10)个核苷酸内。在另一个方面，所述esxJ探针包括允许二级结构形成的核酸序列。这样的二级结构形成通常导致第一荧光部分和第二荧光部分之间的空间接近。根据该方法，所述探针上的第二荧光部分可以是猝灭剂。其它实施方案提供了包含选自SEQIDNO:1-40的核苷酸序列或由其组成的寡核苷酸。本专利技术的其它实施方案提供了一种组合物，其包含适合用于从结核分枝杆菌(MTB)和MTB-复合物的其它成员生产一种或多种扩增产物的寡核苷酸引物组，其包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，所述第一寡核苷酸引物包含选自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8和9的核酸序列或由其组成，所述第二寡核苷酸引物包含选自SEQIDNO:10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和21或其互补物的核酸序列或由其组成，所述寡核苷酸引物具有100个或更少的核苷酸。在某些实施方案中，所述组合物还包含可检测的esxJ探针，所述探针包含选自SEQIDNO:22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40或其互补物的序列或由其组成。在某些实施方案中，所述寡核苷酸引物和/或所述寡核苷酸探针具有100个或更少的核苷酸。在某些实施方案中，所述寡核苷酸引物和/或所述寡核苷酸探针具有40个或更少的核苷酸。在某些实施方案中，所述寡核苷酸探针包含供体荧光部分和对应的受体部分。在某些实施方案中，所述供体荧光部分和对应的受体部分是在所述探针上彼此的不超过8-20个核苷酸内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测样品中的结核分枝杆菌(MTB)和MTB‑复合物的其它成员的方法，所述方法包括：‑ 执行扩增步骤，其包括使所述样品与

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.06 US 14/8194271.一种检测样品中的结核分枝杆菌(MTB)和MTB-复合物的其它成员的方法，所述方法包括：-执行扩增步骤，其包括使所述样品与esxJ引物组接触，如果esxJ核酸存在于所述样品中的话则产生扩增产物；-执行杂交步骤，其包括使所述扩增产物与一种或多种可检测的esxJ探针接触；和-检测所述扩增产物的存在或不存在，其中所述扩增产物的存在指示MTB在所述样品中的存在，且其中所述扩增产物的不存在指示MTB在所述样品中的不存在；其中所述esxJ引物组包含第一引物和第二引物，所述第一引物包含选自SEQIDNO:1-9或其互补物的第一寡核苷酸序列，所述第二引物包含选自SEQIDNO:10-21或其互补物的第二寡核苷酸序列；且其中所述可检测的esxJ探针包含选自SEQIDNO:22-40或其互补物的第三寡核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中：-所述杂交步骤包括使所述扩增产物与可检测的esxJ探针接触，所述esxJ探针用供体荧光部分和对应的受体部分标记；且-所述检测步骤包括检测所述探针的供体荧光部分和受体部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中所述荧光的存在或不存在指示MTB在所述样品中的存在或不存在。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述扩增步骤采用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。4.根据权利要求2和3中的任一项所述的方法，其中所述供体荧光部分和对应的受体部分是在所述探针上彼此的不超过8-20个核苷酸内。5.根据权利要求2-4中的任一项所述的方法，其中所述受体部分是猝灭剂。6.一种用于检测结核分枝杆菌(MTB)和MTB-复合物的其它成员的核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：-第一寡核苷酸引物，其包含选自SEQIDNO:1-9或其互补物的第一寡核苷酸序列；-第二寡核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：JA约翰逊，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH