识别影响表型的遗传元件的分析制造技术

本发明专利技术包括用于识别影响感兴趣的细胞内表型的内源生理相关的遗传元件的通用方法。在所述方法中，将已进行诱变处理的非活细胞基于表型进行分选并分析从而识别遗传元件。通过使用这些方法，可识别先前未知参与表型的元件，例如与健康状况、外部应激或药物反应相关，特别是在癌症中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】识别影响表型的遗传元件的分析
基于诱变的遗传学已用于研究多种不同的表型。该强大的方法已识别细胞分裂需要的基因(通过搜索温度敏感突变酵母菌株)、早期胚胎发育(通过筛选蝇类中的异常胚胎发生)和程序性细胞死亡(通过研究秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的发育中的细胞死亡)。通常，将选择的有机体诱变处理，并且检查所得后代(有时在杂交后)的感兴趣的表型。
技术介绍
在这些情况下，重要的是可以使用活的突变有机体从而将感兴趣的突变与所观察的表型联系。在一些情况下，表型是致死的或降低适应性(fitness)(例如果蝇中的早期发育缺陷或酵母中的细胞分裂表型)。对于这类表型，可将主效突变(causativemutation)可映射在受影响的后代的亲代中，或可利用温度敏感的等位基因。通常，遗传筛选中的一种主要问题是存在高水平的“噪声(noise)”，显著地妨碍与所研究的表型相关的相关候选物(candidate)/基因的识别。这类噪声的实例包括存在结果是不相关、或不可重复等的大量潜在命中(hit)。因此遗传筛选不仅需要繁复的实验和后续研究来在识别的很多潜在命中中发现相关的，而且还意味着只有非常强的信号可能挑选出。遗漏了在筛选中较不强的但在与所研究的表型的关系中相关的信号/命中。鉴于此，允许例如在真核系统中基于在细胞内表现的(即在细胞中或有机体的细胞中存在)、或仅可在细胞内检测的(需要进入细胞内部)表型性状的可靠遗传筛选的用于高通量手段的方法是高度期望的，但尚不容易用于在大群体(库(pool)、混合库(complexpool))的修饰细胞(存在突变的异种群体)进行基于诱变的遗传学或其他遗传筛选。特别地，本领域明确需要可靠、有效和可重复的方法，所述方法允许直接识别影响细胞或有机体的表型(即涉及改变或提供给定特征的某个性状)的未知的遗传元件(geneticelement)(基因、外显子、内含子、SNP等)，包括由于高水平的噪声而在现有技术遗传筛选中将难以识别的这种遗传元件。这对于在细胞内表现(或仅可在细胞内检测)的那些表型特别相关。具有这种方法将同时允许与这些遗传元件相关的细胞元件(cellularelement)(包括但不限于由这种遗传元件表达或调控的蛋白质、这种细胞元件和/或由这些细胞元件调控或产生的相关生物分子(例如脂质、其他蛋白质或酶、代谢物)的活性)的识别。
技术实现思路
因此，可在提供符合任何上述需要的这种方法中见到本专利技术的基本的技术问题。通过权利要求和下文中表征的实施方案来解决所述技术问题。本专利技术的目的是提供允许识别影响表型、优选(至少部分)在细胞内表现和/或需要在细胞内检测的遗传元件特别是内源遗传元件的方法或改进的方法。本专利技术的进一步目的是提供允许识别与影响表型的遗传元件相关的细胞元件的方法。本专利技术的目的是提供允许从已进行诱变处理的大细胞群体中识别一种或多于一种遗传元件(和/或与其相关的细胞元件)的方法，其中各单独的遗传元件、或组合影响在细胞内表现和/或在细胞内检测的表型。本专利技术的目的是提供正向遗传筛选(forwardgeneticscreen)，其允许识别影响在细胞内表现和/或在细胞内检测的表型的遗传元件(和/或与其相关的细胞元件)特别是内源遗传元件。本专利技术的目的是提供这样的正向遗传筛选，其不受或较小程度地受相对高的噪声与相关命中之比的妨碍，换言之示出低水平的噪声即不相关命中。因此这允许相关遗传元件的直接识别，并且可防止或减少其他繁复的验证研究。本专利技术的目的是提供真核细胞中的上述内容，所述真核细胞例如但不限于人类细胞，包括携带致病突变的细胞，例如人类癌细胞。本专利技术的目的还是提供识别由影响细胞表型的候选基因编码的基因产物、特别是内源基因产物的调节剂(modulator)例如药物的方法。本专利技术的目的是提供建立或分析用于识别疾病例如但不限于癌症涉及的基因、用于研究药物-靶标相互作用、用于研究药物-药物相互作用、或分析表型优选与包括癌症的疾病相关的表型的抑制或调控的生物通路的方法。用本文公开的本专利技术的方法解决这些和其他目的。附图说明图1.对已用多聚甲醛固定的诱变的细胞群体的遗传筛选。图2.诱变的细胞库的表型分离和通过测序的基因陷阱(gene-trap)插入位点的识别。图3.识别AKT磷酸化的调节因子(regulator)的全基因组(genome-wide)诱变筛选。图4.KCTD5影响AKT磷酸化。图5.筛选方法适用于可以可视化的和用于基于信号强度分离细胞群体的任何细胞内表型。图6.IRF1蛋白质水平(蛋白质表达)的筛选。图7.IκBα表达(蛋白质降解)的筛选。图8.p38磷酸化的筛选。图9.辐射的细胞中的DNA损伤的筛选。图10.组蛋白尾修饰(histonetailmodification)的筛选。图11.KCTD5调节GPCR信号传导。图12.基于CRISPR/Cas9的筛选识别KCTD5为磷酸-AKT(pAKT)负调节因子。图13.一组表型中基因相关表型的比较。图14.组蛋白中相同氨基酸处两种相似的翻译后修饰(posttranslationmodification,PTM)所需要的基因的比较分析。图15.溶酶体蛋白LAMP1丰度的筛选。图16.单倍体遗传筛选识别在突变时改变疾病标记物水平的基因。具体实施方式定义在以下描述和实例中，使用多个术语。为了提供说明书和权利要求的清楚的和一致的理解(包括待给予这类术语的范围)，提供以下定义。除非本文另有定义，所使用的所有技术和科学术语具有如本专利技术所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的公开内容全部引入本文以作参考。如本文所使用的，除非另有定义，术语“普通科学术语”指的是具有如本专利技术所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义的技术和科学术语。本领域技术人员将认识到可用于本专利技术实施的与本文所述的那些相似或等同的很多方法和材料。的确，本专利技术决不限于所述的方法和材料，并且分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因组学、测序和相关领域内的常规技术的实施是本领域技术人员公知的。如本文所使用的，除非上下文清楚地另有指示，单数形式"一个/种(a,an)"和"所述"包括复述指示对象(pluralreferents)。例如，用于分离"一个"DNA分子的方法包括分离多个分子(例如几十、几百、几千、几万、几十万、几百万或更多个分子)。如本文所使用的，并且除非特别说明或从上下文明显看出，术语"约"理解为在本领域的一般公差(normaltolerance)的范围内，例如在平均值的2个标准差内。约可理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％内。如本文所使用的，术语“和/或”表示所述情况的一个或多个可单独发生或与至少一种所述情况直至与所有所述情况组合发生。如本文所使用的，"至少"特定值意为特定值以上。例如，"至少2"理解为与"2以上"即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、…等相同。如本文所使用的，术语“扩增”指的是多核苷酸扩增反应，即，从一种或多种起始序列复制的多核苷酸群体。扩增可指多种扩增反应，包括但不限于聚合酶链本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于识别影响细胞的表型的遗传元件的方法，优选其中所述表型在细胞内表现，所述方法包括以下步骤：(a)将细胞库进行诱变处理；(b)固定所述细胞库，优选用固定试剂和任选地用交联剂进行；和透化所述细胞库，优选用透化试剂进行；(c)用一种或多种可检测探针、优选抗体或RNA探针处理所述细胞库，从而检测受影响的表型；(d)基于所述一种或多种可检测探针的至少一种的检测来分选所述细胞，从而获得一种或多种细胞群体；(e)任选地，去交联所得细胞群体各自中的细胞；和(f)测序至少部分所得细胞群体的至少部分细胞，从而识别影响所述细胞的所述表型的遗传元件。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.28 NL 20148771.一种用于识别影响细胞的表型的遗传元件的方法，优选其中所述表型在细胞内表现，所述方法包括以下步骤：(a)将细胞库进行诱变处理；(b)固定所述细胞库，优选用固定试剂和任选地用交联剂进行；和透化所述细胞库，优选用透化试剂进行；(c)用一种或多种可检测探针、优选抗体或RNA探针处理所述细胞库，从而检测受影响的表型；(d)基于所述一种或多种可检测探针的至少一种的检测来分选所述细胞，从而获得一种或多种细胞群体；(e)任选地，去交联所得细胞群体各自中的细胞；和(f)测序至少部分所得细胞群体的至少部分细胞，从而识别影响所述细胞的所述表型的遗传元件。2.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤(d)中，基于所述一种或多种可数据探针的至少一种的检测来分选所述细胞，获得至少两种细胞群体，其中在步骤(f)中，将至少两种细胞群体测序和比较，从而识别影响所述细胞的所述表型的遗传元件。3.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述遗传元件选自由以下组成的组：基因、内含子、外显子、启动子和非编码RNA。4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的组：真核细胞、动物细胞、植物细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、人类细胞、或干细胞。5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述细胞为近单倍体细胞或完全单倍体细胞，优选近单倍体细胞或完全单倍体哺乳动物细胞，更优选近单倍体细胞或完全单倍体细胞人类细胞。6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述诱变为随机诱变。7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述诱变涉及以下的使用：辐射，诱变化学品，优选甲磺酸乙酯、亚硝酸、或乙基亚硝基脲，插入诱变，优选基于转座子的插入诱变或基于逆转录病毒的(随机)插入诱变，引导RNA序列的CRISPR文库。8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中将所述细胞暴露于应激条件或生长条件，和/或其中用化合物、优选药物处理所述细胞，优选在步骤(b)中固定和透化所述细胞之前，优选在进行步骤(a)和步骤(b)之间。9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中固定所述细胞的所述固定试剂选自由以下组成的组：交联试剂，优选甲醛、多聚甲醛、福尔马林和戊二醛，或非交联试剂，优选基于氯化汞的固定剂、乙醇、甲醇或丙酮，和/或其中所述透化试剂选自由以下组成的组：溶剂，优选甲醇和丙酮，或洗涤剂，优选皂苷、毛地黄皂苷、TritonX-100、NP-...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·R·布鲁梅尔坎普，J·D·M·尼乌文赫伊斯，L·T·杰，M·布罗克曼，V·A·布洛梅恩，M·拉本，
申请(专利权)人：施特丁奈德兰卡克研究所安东尼范列文虎克医院，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL