用于自然杀伤细胞扩增的方法技术

本发明专利技术提供了一种用于在包含自然杀伤(NK)细胞群体的细胞培养基中体外培养和扩增NK细胞的方法，所述方法包括a)在培养过程开始时将有效浓度的白细胞介素‑21(IL‑21)加入至所述培养基中，b)将有效浓度的白细胞介素‑2(IL‑2)和/或白细胞介素‑15(IL‑15)反复地加入至所述培养基中，和c)将饲养细胞或其膜颗粒反复地加入至所述培养基中，其中所述饲养细胞是B细胞衍生的，其是EBV永生化的；和其中所述细胞培养基中NK细胞的所述扩增维持至少3周。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于自然杀伤细胞扩增的方法
本专利技术涉及离体培养中自然杀伤细胞(“NK细胞”)数量的有效增加，并且更具体地，但不是排他地，通过用饲养细胞和细胞因子处理细胞。
技术介绍
自然杀伤细胞(以下也简称为“NK细胞”)是独特的淋巴细胞群体，其能够检测和破坏病毒感染的细胞和恶性地退化的细胞(也称为肿瘤细胞)。此外，NK细胞在与肿瘤细胞接触时产生并分泌细胞因子。这些功能特征使得NK细胞成为用于癌症治疗的有吸引力的药物。临床试验已经突出了NK细胞的临床使用的潜力(Miller2005,Rubnitz2010,Miller2013,Childs,Berg2013)。将供体NK细胞用于患者(“同种异基因使用”)需要细胞分离方法以将想要的NK细胞效应与非NK细胞(例如T细胞)的不想要的、禁忌效应分离。这些方法被完善地建立(Leung2014)并且可以在封闭的无菌系统中自动化(Apel2013)。可以从供体的白细胞分离术收获物获得的最大NK细胞剂量被限制为约2×108个纯化的NK细胞。NK细胞输注到患者中的有益效果是剂量依赖性的，预期接受更高NK细胞数量的患者的更好临床结果。目标细胞数量是2×109至1×1011个NK细胞以最大化NK细胞输注的有益效果。嵌合抗原受体(以下简称“CAR”)可以将细胞毒性免疫效应细胞导向肿瘤细胞。进行临床试验以评估患者衍生(“自体”)CART细胞的临床安全性和功效。用CAR修饰NK细胞而不是T细胞允许健康供体衍生的(“同种异基因的”)免疫效应细胞的使用(Glienke2015)。来自患者或供体的原代细胞的使用允许制造用于单个患者的临床细胞剂量。用于多个患者的细胞产品的制造需要使用可以不受限制地增殖的细胞，例如肿瘤衍生的细胞系。用CAR修饰的NK细胞系可用于临床方案(NK-92，Klingemann，2014)。使用细胞系治疗患者需要通过照射停止生长以避免在转移到患者后细胞系继续生长。这也降低了效应细胞的存活和功能性。此外，细胞系具有同质的表型和功能，没有像原代免疫效应细胞那样提供针对肿瘤细胞的广泛反应性。已经描述了多种方案以诱导体外NK细胞增殖以增加NK细胞数量，在下文中也被描述为“NK细胞扩增”，在其他来源也被描述为“NK细胞增加”。NK细胞可以通过与细胞因子组合培养、通过用小分子(例如烟酰胺)补充细胞培养基以及通过细胞因子、抗体和饲养细胞的组合而体外扩增。基于细胞因子的NK细胞培养导致细胞数量仅少量增加，其不足以制造用于多个患者的NK细胞产物，或从小NK细胞亚群制造NK细胞产物。在这些方案中NK细胞在3周后停止生长，延长的培养不导致更高的NK细胞数量。基于饲养细胞的NK细胞扩增方案产生更高的NK细胞数量。有效的方案需要遗传修饰饲养细胞(K562)或通过用爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-BarrVirus)感染而自然地永生化的B细胞系的使用。在与遗传修饰K562细胞(膜结合IL-15)的共培养中扩增的NK细胞在4周时变得衰老，继续被遗传工程化以表达膜结合IL-21的K562细胞的使用以扩增至多6周。B细胞可以通过用爱泼斯坦-巴尔病毒自然感染B细胞而永生化。这些EBV-LCL可用于有效扩增NK细胞，而没有饲养细胞的进一步遗传修饰(Childs,Berg2013,Denman2012)。与EBV-LCL共培养的NK细胞的长期培养只可以在NK细胞的非常小的亚组中维持至多6个月的持续生长(Hercend,1982)，不保持起始NK细胞群体的表型和功能的初始异质性并且仅提供有限数量的NK细胞。因此需要用于扩增NK细胞的改进的体外方法，其允许扩增NK细胞至非常高的数量，优选地扩增至足以符合扩增的NK细胞在患者中的临床应用的临床试验需要的数量。
技术实现思路
令人惊奇地，发现NK细胞可以在培养数周内在细胞培养系统中扩增(增殖)至非常高的数量，例如在包含2.5×104个NK细胞/mL或5.25×105个总细胞/mL(包括饲养细胞)的群体的细胞培养基中使用标准起始浓度的NK细胞在7周内扩增至NK细胞的l×1011倍扩增。通过这种NK细胞的l×1011倍扩增达到的细胞数量足以用于临床应用，例如细胞治疗，例如用于白血病和其他癌症的过继免疫治疗。预料不到地，在NK细胞的培养过程开始时，将有效浓度的白细胞介素-21(IL-21)加入至适合于扩增NK细胞的细胞培养基中，结合饲养细胞(其是B细胞衍生的和EBV转化的，例如爱泼斯坦-巴尔病毒转化的类淋巴母细胞细胞系(EBV-LCL))的存在，并在整个NK细胞培养期间反复地加入B细胞衍生的和EBV转化的新鲜饲养细胞(例如EBV-LCL)，导致非常高数量的扩增的NK细胞。优选地，在先前的所述饲养细胞添加之后每5至16天一次，将新鲜的饲养细胞加入到培养基中，更优选地在先前的所述饲养细胞添加之后每6至14天一次，最优选地在先前的所述饲养细胞添加之后每13天。在培养过程在所述细胞培养基中在后期时间点反复添加IL-21或甚至永久存在IL-21对于NK细胞扩增过程是起反作用的。令人惊讶的是在本文公开的条件下，NK细胞的扩增可以在数周内进行而不损失NK细胞数量的增加(存在NK细胞数量在持续时间上的相关性)。扩增的持续可以进行(维持)超过例如5、10、15、20、25、30或更多周。在包含NK细胞群体的细胞培养基中NK的起始浓度可以在1个细胞/mL和2×107个细胞/mL之间，优选地20个细胞/mL和2×107个细胞/mL之间。更令人惊讶的是，发现当包含NK细胞群体的细胞培养基中NK细胞/mL的起始浓度在1个细胞/mL和2.5×104个细胞/mL之间时，优选地在20个细胞/mL和2.5×104个细胞/mL之间，即NK细胞的起始浓度低于NK细胞的标准起始浓度，其在常见的NK细胞扩增方案中通常高于7×104个NK细胞/mL，本文公开的方法导致NK细胞的特别高的扩增。这是预料不到的，因为通常需要临界细胞密度以使NK细胞能够体外扩增，因为NK对NK的相互作用确保NK细胞的存活、活化和增殖(Kim2014)。如本文公开的用于NK细胞扩增的方法可以完全地作为自动化过程实施，优选地在GMP条件下的封闭系统中。附图说明图1：EBV-LCL存在下NK细胞起始浓度对NK细胞扩增的影响图2：在取决于饲养细胞与NK细胞的比率的不同IL-2浓度下饲养细胞介导的NK细胞扩增：显示在不同IL-2浓度下实现在与EBV-LCL共培养中的NK细胞扩增。此外，更高的EBV-LCL与NK细胞的比率导致更高的NK细胞扩增，证明EBV-LCL以剂量依赖性方式诱导NK细胞扩增。图3：不同细胞因子组合对饲养细胞介导的NK细胞扩增的影响：显示IL-2和/或IL-15可以用于扩增在与EBV-LCL共培养中的NK细胞。此外，EBV-LCL介导的NK细胞扩增可以通过另外地使用IL-21而显著增加。图4：在不同浓度的IL-21下饲养细胞介导的NK细胞扩增：EBV-LCL介导的NK细胞扩增可以通过IL-21以剂量依赖性方式增加。图5：在B细胞衍生的饲养细胞存在下永久添加相对于短期添加IL-21对NK细胞扩增的影响：为了通过使用IL-21增加NK细胞扩增，只要在培养过程开始时加入IL-21就足够。令人惊讶的是，IL-21的永久添加甚至起反作用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于在包含自然杀伤(NK)细胞群体的细胞培养基中体外培养和扩增NK细胞的方法，所述方法包括：a)在培养过程开始时将有效浓度的白细胞介素‑21(IL‑21)加入至所述培养基中；b)将有效浓度的白细胞介素‑2(IL‑2)和/或白细胞介素‑15(IL‑15)反复地加入至所述培养基中；c)将饲养细胞或其膜颗粒反复地加入至所述培养基中，其中所述饲养细胞是B细胞衍生的，其是EBV永生化的；和其中所述细胞培养基中NK细胞的所述扩增维持至少3周。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.04 EP 15183968.51.一种用于在包含自然杀伤(NK)细胞群体的细胞培养基中体外培养和扩增NK细胞的方法，所述方法包括：a)在培养过程开始时将有效浓度的白细胞介素-21(IL-21)加入至所述培养基中；b)将有效浓度的白细胞介素-2(IL-2)和/或白细胞介素-15(IL-15)反复地加入至所述培养基中；c)将饲养细胞或其膜颗粒反复地加入至所述培养基中，其中所述饲养细胞是B细胞衍生的，其是EBV永生化的；和其中所述细胞培养基中NK细胞的所述扩增维持至少3周。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养基中IL-21的所述有效浓度在0.1和1000ng/mL之间。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞培养系统中IL-2的所述有效浓度在1U/mL和5000U/mL之间，和/或所述细胞培养系统中IL-15的所述有效浓度在0.1和1000ng/mL之间。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述将饲养细胞反复地加入至所述培养基中是在先前的饲养细胞添加之后的第5天和第16天之间进行。5.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·格兰青，V·胡珀特，
申请(专利权)人：美天旎生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE