流感A/SHANGHAI/2/2013 H7序列的改性H7血凝素糖蛋白制造技术

本发明专利技术涉及流感A/Shanghai/2/2013H7序列的H7血凝素糖蛋白的序列修饰以及由其衍生的疫苗。另外，本发明专利技术还包括通过修饰T细胞表位来改善疫苗抗原效力的方法。

Modified H7 hemagglutinin glycoprotein of influenza A/SHANGHAI/2/2013 H7 sequence

The present invention relates to the sequence modification of the H7 hemagglutinin glycoprotein of the sequence of influenza A/Shanghai/2/2013H7 and the vaccine derived from it. In addition, the invention also includes methods to improve the potency of the vaccine antigen by modifying the epitopes of T cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】流感A/SHANGHAI/2/2013H7序列的改性H7血凝素糖蛋白关于在联邦政府赞助的研究和开发项下专利技术的权利的声明本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的基金号为AI082642的美国政府财政支持下完成的。美国政府在本专利技术中可能有一定的权利。相关申请的交叉引用本申请要求于2015年5月4日提交的名称为“MODIFIEDH7HEMAGLUTTININGLYCOPROTEINOFTHEINFLUENZAA/SHANGHAI/2/2013H7SEQUENCE”、申请号62/156,718的美国临时专利申请的优先权。上述申请的全部内容通过引用并入本文。参考电子提交的序列表本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且通过引用将其全部内容并入本文。所述ASCII拷贝，创建于2015年3月25日，被命名为“SEQUENCELISTINGMODIFIEDH7_ST25”，大小为10.6KB。
本专利技术是流感A/SHANGHAI/2/2013H7序列的H7血凝素糖蛋白的序列修饰。针对两种不同的新发A型流感病毒(IAV)，2009大流行H1N1(A(H1N1)pdm09)和H7N9禽流感(H7N9)，开发的疫苗的不一致的免疫原性提供了评估T细胞在有效体液免疫应答发展中的角色的机会。例如，虽然A(H1N1)pdm09是高度可传播的并由于缺乏预先存在的抗体而在出现后的12个月内传播至200多个国家，但由于A(H1N1)pdm09流感引起的发病率和死亡率低于预期，可能是由于暴露于季节性A(H1N1)毒株或接种季节性A(H1N1)疫苗的个体中预先存在的T细胞应答。2013年H7N9在中国的出现与更高的致死率相关。由于担心其致死率和大流行性，H7N9疫苗被优先考虑用于生产，并开发了疫苗。流感疫苗可以唤醒记忆T细胞在不存在佐剂的情况下产生保护性免疫并刺激抗体应答；因此，通常只需要接种一次疫苗就能对季节性流感病毒株产生保护性免疫。在中国已被证明，与其他亚基和季节性流感疫苗相比，传统的重组H7血凝素疫苗生产用以解决禽源H7N9流感的再出现(假定交叉反应性体液免疫被推定为不存在)具有较差的功效。与A(H1N1)pdm09形成鲜明对比的是，未佐剂化的H7N9疫苗抗原性差，并且用未佐剂化的H7N9血凝素(HA)接种导致在I期临床试验中血细胞凝集抑制(HI)血清转化率仅为6％和15.6％(相比之下，类似的未佐剂化的A(H1N1)pdm09亚基疫苗为89％)。这些疫苗的临床试验要求使用佐剂将这些疫苗的抗原性提高到可接受的标准，然而在美国，标准的季节性流感疫苗不使用佐剂。即使用两剂H7N9疫苗与佐剂一起给新型病毒产生新的记忆T辅助细胞，在最近的II期临床试验中，只有59％的受试者血清转化。与对其他IAV感染的典型免疫应答相比，在H7N9感染的人类中H7N9的中和抗体的发展也延迟，并且对H7N9HA的IgG亲合力显著较低。在其他H7亚型的临床试验中，减毒H7N1疫苗引起低HI滴度(titer)，失活的亚单位H7N7疫苗免疫原性差。H7HA似乎是独特的非抗原性的。在荷兰2003年发生的H7N7暴发中观察到的相关H7HA的人类抗体应答也在HI滴度中降低。综上所述，这些研究表明，对H7N9感染的适应性免疫应答可能会减弱和延迟，即使在自然感染的情况下。CD4+T细胞向B细胞提供帮助，支持同种型转换和亲和力成熟(affinitymaturation)；因此，减少和延迟的对H7HA的抗体应答表明T细胞的帮助被限制或废除。H7N9序列中的CD4+T辅助表位比其他IAV中少。已经在适应于人类宿主的慢性(“命中和保持”(hit-and-stay))病毒中观察到类似的表位缺失(epitopedeletion)模式，例如EpsteinBarr病毒(EBV)和单纯疱疹病毒(HSV)，但未在急性(“命中和跑”(hit-and-run))病毒中发现。表位缺失介导的免疫逃逸是人类免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)病毒发病机制的公认机制，但是这种逃逸机制以前尚未在流感描述过。H7N9可能使宿主应答最小化的另一种手段是采用“免疫伪装”，这是我们团队确定的一种免疫逃逸的新机制。可以使用JanusMatrix(EpiVax，Providence，RI，USA)来鉴定来源于具有与人类序列的高T细胞受体(TCR)“交叉保守性”的病原体的T细胞表位，该算法比较面向TCR的模式的CD4+T细胞表位存在于人类基因组中。JanusMatrix是一种同源性分析工具，考虑了未被原始序列比对捕获的抗原识别方面。与未在人体中建立慢性感染的病毒相比，共生病毒含有明显更高数量的这些JanusMatrix定义的“类人(human-like)”T细胞表位。HCV含有与自身高度交叉保守的表位，并在体外显著扩增T调节性细胞(Treg)。响应于这种肽的T细胞表现出Treg特征性的标志物，并在体外有效地抑制旁观者效应T细胞应答。慢性病病毒(似乎有许多这样的表位)和急性病病原体病毒之间的显著区别表明，免疫伪装可能是某些人类病原体逃逸适应性免疫应答的重要方法。对于包含在新流感毒株中的表位具有特异性的预先存在的异型T细胞记忆免除了对佐剂的需要，并且在A(H1N1)pdm09(GreenbergME等人，N.Engl.J.Med.，361：2405-13，2009)观察到有效的抗体滴度可能在单次剂量后发生。尽管召回预先存在的免疫性的T细胞表位可以帮助针对A(H1N1)pdm09流感(LaurieKL等人，J.Infect.Dis.，202：1011-20，2010)观察到的针对多种病毒亚型的保护，但是表位类似宿主序列可能对免疫是有害的。在大型表位数据库中公开的病毒表位的回顾性分析中，更大的人类交叉保守性与缺乏或调节性T细胞应答有关(HeL等人，BMCBioinformatics，15：S1，2014)。综合起来，这些发现表明，某些人类病原体可能进化为在其蛋白组中包含T细胞表位，其类似于重要的人类调节性T细胞表位(“免疫伪装”)。H7N9的T细胞表位谱(少数效应T细胞表位和许多交叉保守的表位)与‘命中和保持(hit-and-stay)’的病毒相比更接近这些‘命中和跑(hit-and-run)’病毒。尽管H7N9的人与人之间的传播是罕见的，但已经注意到该病毒具有“哺乳动物标签(mammaliansignature)”。已经报道了有限的人与人之间的传播的病例(GaoHN等，Int.J.Infect.Dis.，29C：254-8，2014)。H7N9的人与人之间的传播可能比怀疑更频繁地发生，这使得由于抗体滴度低而难以检测。H7N9蛋白组中类人表位的发现提出了关于H7N9的起源和进化及其在人类或其它哺乳动物中流行的持续时间的重要问题。使用免疫信息学工具包分析H7N9基因组(在2013年4月2日公开于GISAID网站上)。分析表明H7HA具有比预期少的T细胞表位而且免疫原性差。因此，需要不使用佐剂来增加抗原性的具有更高效力的流感疫苗来解决中国的禽源H7N9流感的再出现。
技术实现思路
本专利技术提供了流感A/SHANGHAI/2/2013H7序列(SEQIDNO：2)的H7血凝素糖蛋白的序列修饰。野生型病毒中的三个氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含SEQ ID NO：2的完整氨基酸序列的多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.04 US 62/156,7181.包含SEQIDNO：2的完整氨基酸序列的多肽。2.编码权利要求1的多肽的核酸。3.包含如权利要求2所述的核酸的载体。4.含有如权利要求3所述的载体的细胞。5.一种疫苗，其包含一种或多种包含SEQIDNO：2的完整氨基酸序列的多肽或其片段，条件是所述片段含有SEQIDNO：3。6.权利要求5的疫苗，其进一步包含佐剂。7.一种组合物，其包含一种或多种包含SEQIDNO：2的完整氨基酸序列的多肽或其片段，条件是所述片段含有SEQIDNO：3。8.用于针对流感接种疫苗的方法，包括向受试者施用包含一种或多种包含SEQIDNO：2的全部氨基酸序列的多肽或其片段的组合物，条件是所述片段含有SEQIDNO：3。9.如权利要求8所述的方法，其中所述组合物还包含佐剂。10.如权利要求8所述的方法，其中所述流感是禽源H7N9流感。11.增强抗H7抗体应答的方法，包括给予一种组合物，所述组合物包含一种或多种包含SEQIDNO：2的完整氨基酸序列的多肽或其片段，条件是所述片段含有SEQIDNO：3。12.如权利要求11所述的方法，其中所述组合物还包含佐剂。13.一种试剂盒，其包含一种或多种包含SEQIDNO：2的氨基酸序列的多肽或其片段，条件是所述片段含有SEQIDNO：3。14.如权利要求13所述的试剂盒，还包含佐剂。15.一种改善疫苗抗原对所选病原体效力的方法，包括以下步骤：(a)鉴定与来源于人类蛋白组或人类微生物组的蛋白共有TCR接触的组成T细胞表位；和(b)对所述T细胞表位进行修饰以降低MHC结合和/或降低所述靶T细胞表位与人类蛋白组或人类微生物组的TCR接触之间的同源性；条件是抗所述疫苗抗原和相关野生型蛋白的抗体之间的功能对应性被充分保留。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述表位与调节性T细胞结合或不能结合效应T细胞。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述修饰用不同T细胞表位的氨基酸序列取代所述靶T细胞表位的氨基酸序列。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述修饰降低所述靶T细胞表位与人类基因组、人类微生物组或两者之间的同源性。19.根据权利要求16所述的方法，其中针对所述疫苗抗原和相关的野生型蛋白产生的抗体之间的功能对应性不被所述靶T细胞表位的修饰所中断。20.根据权利要求17所述的方法，其中所述靶T细胞表位的被取代的氨基酸序列来源于疫苗抗原的变体序列。21.根据权利要求17所述的方法，其中所述靶T细胞表位的被取代的氨基酸序列源自与所述靶T细胞表位同源的蛋白的氨基酸序列。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述被取代的氨基酸序列存在于含有所述疫苗抗原的病原体的毒株或进化枝中。23.根据权利要求15所述的方法，其中所述改性的T细胞表位诱导先前未暴露于导致所述疫苗抗原的病毒的受试者中的记忆T细胞的应答。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述对象是人类对象。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述受试者先前已经暴露于所述病原体。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述受试者通过接种疫苗暴露于所述病原体。27.根据权利要求25所述的方法，其中所述受试者通过自然感染暴露于所述病原体。28.根据权利要求15至27中任一项所述的方法，其中所述疫苗抗原靶向流感病毒的HA蛋白。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述流感病毒是流感病毒A、流感病毒B或流感病毒C。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述流感病毒是流感病毒A。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述流感病毒A是血清型H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7或H7N9。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述血清型是H7N9。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述H7N9血清型是流感A/SHANGHAI/2/2...

【专利技术属性】
技术研发人员：A德格鲁特，W马丁，
申请(专利权)人：埃皮瓦克斯公司，
类型：发明
国别省市：美国,US