一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物及通过PCR试剂盒检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物及通过PCR试剂盒检测的方法，通过URP通用引物扩增尖孢镰孢菌不同专化型，获得URP‑32F引物苦瓜枯萎病菌尖孢镰孢菌苦瓜专化型的特异性扩增条带，通过参考比对尖孢镰孢菌公开的基因组序列，设计了可用于检测苦瓜枯萎病菌尖孢镰孢菌苦瓜专化型的特异性引物及其PCR检测试剂盒；该试剂盒对苦瓜枯萎病菌尖孢镰孢菌苦瓜专化型的检测特异性好、灵敏度高、检测时间短、操作简便，可以实现从土壤和植物样品中快速准确地检测出苦瓜枯萎病菌，而对于其它常见的瓜类枯萎病菌的扩增结果均为阴性；因此，本发明专利技术为苦瓜枯萎病的早期诊断和快速鉴定提供了一种特异性、有效的检测技术手段，而且该方法操作简单、对设备的要求低。

A PCR primer for detection of Fusarium Wilt of balsam pear and the method of detection by PCR Kit

The invention discloses a primer for detecting PCR Bitter Melon Fusarium Wilt and by PCR kit, the common URP amplified Fusarium oxysporum in different biotypes, specific primers of 32F URP bitter gourd Fusarium oxysporum balsam pear biotypes of the amplified bands, comparing genomic sequences Fusarium oxysporum by open box can be used for reference, specific primers and PCR detection reagent for detection of bitter gourd Fusarium oxysporum balsam pear biotypes was designed; the kit of Bitter Melon Fusarium oxysporum balsam pear biotypes detection of high sensitivity and good specificity, detection time a short, simple operation, can be achieved from the plant and soil samples rapidly and accurately detect the Bitter Melon Fusarium wilt, and the amplification results of other common Fusarium oxysporum were negative; therefore, the invention is bitter Early diagnosis and rapid identification of Melon Wilt provide a specific and effective detection technology, and this method is simple and low in equipment requirements.

【技术实现步骤摘要】
一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物及通过PCR试剂盒检测的方法
本专利技术涉及生物技术检测领域，具体是一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物及通过PCR试剂盒检测的方法。
技术介绍
由尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)侵染引起的蔬菜瓜类枯萎病是一种典型土传病害，也是一种毁灭性维管束病害；近年来，由于设施农业的广泛推广，以及作物重茬面积不断扩大，瓜类枯萎病的发生和危害日益严重；瓜类枯萎病发病率一般在10％～30％，严重时高达80％，甚至绝产，且一旦发病，难以根除，已成为影响蔬菜瓜类生产的严重障碍之一。尖孢镰孢菌对不同属(种)寄主植物以及同种寄主植物不同品种的致病性存在明显差异，因此具有高度的寄主专化性；目前，我国已明确报道的尖孢镰孢菌瓜类专化型有6个，分别为黄瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、西瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)、甜瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.melonis)、苦瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.momodicae)、冬瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.benincasae)和葫芦专化型(Fusariumoxysporumf.sp.lagenariae)；研究表明，瓜类枯萎病菌各专化型并非严格的寄主专化性，不同专化型菌株除强侵染相应的寄主植物外，也可侵染其它寄主植物，如尖孢镰孢菌黄瓜专化型菌株除强侵染黄瓜外，还可弱侵染甜瓜和西瓜；尖孢镰孢菌西瓜专化型菌株除强侵染西瓜外，还可弱侵染黄瓜和甜瓜；尖孢镰孢菌苦瓜专化型菌株除强侵染苦瓜外，还可弱侵染葫芦和丝瓜等等；因此，给瓜类枯萎病菌的早期鉴定带了巨大的困难；目前，对瓜类枯萎病菌的鉴定除采用形态学和分子生物学方法外，还必须结合病原菌分离物对不同寄主植物的致病性测定结果；对于由尖孢镰孢菌苦瓜专化型侵染引起的苦瓜枯萎病而言，早期诊断是指导该病害有效防控的关键；但是，目前关于尖孢镰孢菌苦瓜专化型的早期分子检测几乎还是空白，因此，急需一种特异性、灵敏、快速、简便的苦瓜枯萎病菌检测技术；现有的苦瓜枯萎病菌尖孢镰孢菌苦瓜专化型鉴定方法，由于目前并没有公认的鉴别寄主，且接种试验结果受环境条件的影响较大，因此，采用现有的鉴定方法获得的鉴定结果往往具有不确定性，加之，致病性测定的时间长(从接种到发病并表现典型的症状一般为9～13天)，费时费工，不利于苦瓜枯萎病的早期诊断，导致错失病害防控的最佳时机，给生产造成难以挽回的损失。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物及通过PCR试剂盒检测的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物，包括由上游引物和下游引物；所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.No.3，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.No.4所示，分别来自URP-32F(SEQ.ID.No.1)扩增的特异片段SEQ.ID.No.2和经优化的特异性扩增片段SEQ.ID.No.5。一种通过PCR试剂盒检测苦瓜枯萎病菌的方法，包括以下步骤：步骤一，提取待检样品基因组DNA，使用PCR试剂盒进行PCR扩增；步骤二，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有苦瓜枯萎病菌；所述判断具体为：如果电泳结果在294bp位置出现单一的扩增条带，则说明样品中含有苦瓜枯萎病菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有苦瓜枯萎病菌。作为本专利技术进一步的方案：所述PCR试剂盒含有引物FOMM-SPF和引物FOMM-SPR。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤一中所述的PCR试剂盒还含有PCR扩增缓冲液、阳性对照以及阴性对照。作为本专利技术再进一步的方案：所述的阳性对照为含有苦瓜枯萎病菌特异性扩增片段的质粒DNA。作为本专利技术再进一步的方案：所述的阴性对照为无菌水。作为本专利技术再进一步的方案：所述PCR扩增所采用的检测体系为25μl，反应体系包括：2×GreenTaqMasterMix12.5μl，10μM的上下游引物各1μl，模板溶液1μl，最后用灭菌的去离子水补足至25μl。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤一中所述的PCR扩增所采用的扩增程序为：95℃预变性3min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：94℃变性15s，57℃退火30s，72℃延伸20s，循环共30个；循环结束后72℃延伸5min，降温至16℃结束。作为本专利技术再进一步的方案：所述引物FOMM-SPF和引物FOMM-SPR的摩尔比为1:1。作为本专利技术再进一步的方案：所述引物FOMM-SPF和引物FOMM-SPR的浓度均为10μM。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术包括引物FOMM-SPF和引物FOMM-SPR，它们分别具有序列表中SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.4的碱基序列；还制备了相应的PCR试剂盒并建立了相应的检测方法，该试剂盒含有引物FOMM-SPF和引物FOMM-SPR、PCR扩增试剂、尖孢镰孢菌苦瓜专化型阳性对照和阴性对照；具有特异、灵敏、快速、简便的特点，弥补了目前对尖孢镰孢菌苦瓜专化型早期检测的技术空缺，可作为保护地栽培、基础实验室等场所开展快速检测的良好方法；为生产上苦瓜枯萎病的预测预警、早期诊断和有效防控提供及时、准确的信息和指导。说明书附图图1是本专利技术PCR检测方法退火温度实验检测结果图，图中：1-53℃；2-55℃；3-57℃；4-60℃；5-62℃和6-65℃；M.DL2000分子质量标准。图2是本专利技术PCR检测方法特异性实验结果图，图中：M-2000bpDNA标准分子质量,1-尖孢镰孢菌古巴专化型，2-尖孢镰孢菌西瓜专化型，3-尖孢镰孢菌甜瓜专化型，4～9-苦瓜枯萎病菌分离物，10-假禾谷镰孢菌，11-燕麦镰孢菌,12-黄色镰孢菌,13-稻恶苗病菌,14-亚洲镰孢菌,15-禾谷镰孢菌。图3是本专利技术特异性检测实验ITS检测各菌株的DNA质量，图中样品与图2相对应：M-2000bpDNA标准分子质量,1-尖孢镰孢菌古巴专化型，2-尖孢镰孢菌西瓜专化型，3-尖孢镰孢菌甜瓜专化型，4～9-苦瓜枯萎病菌分离物，10-假禾谷镰孢菌，11-燕麦镰孢菌,12-黄色镰孢菌,13-稻恶苗病菌,14-亚洲镰孢菌,15-禾谷镰孢菌。图4是本专利技术PCR检测方法灵敏性试验结果图，图中：1-50ng；2-20ng；3-10ng；4-5ng；5-2ng；6-1ng；7-0ng；M,2000bpDNAladder。图5是本专利技术PCR检测方法的土壤的检测结果图，图中：1-5×101个分生孢子；2-5×102个分生孢子；3-5×103个分生孢子；4-5×104个分生孢子；5-5×105个分生孢子；6-阴性对照-未加分生孢子的土壤；7-阳性对照-基因组DNA；8-无菌水；M-2000bpDNA标准分子量。图6是本专利技术PCR检测方法检测接种苦瓜枯萎病菌后12天苦瓜植株带菌检测结果图，图中：1、2：接种的苦瓜子叶；3、4、6、7：接种的苦瓜根；5、8、9：接种的苦瓜叶柄，10-未接种苦瓜叶柄对照；11-未接种苦瓜根对照；12-阳性对照。图7是本专利技术PCR检测方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物，其特征在于，包括由上游引物和下游引物；所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.No.3，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.No.4所示，分别来自URP‑32F(SEQ.ID.No.1)扩增的特异片段SEQ.ID.No.2和经优化的特异性扩增片段SEQ.ID.No.5。

【技术特征摘要】
1.一种检测苦瓜枯萎病菌的PCR引物，其特征在于，包括由上游引物和下游引物；所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.No.3，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ.ID.No.4所示，分别来自URP-32F(SEQ.ID.No.1)扩增的特异片段SEQ.ID.No.2和经优化的特异性扩增片段SEQ.ID.No.5。2.一种如权利要求1所述的一种通过PCR试剂盒检测苦瓜枯萎病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，提取待检样品基因组DNA，使用PCR试剂盒进行PCR扩增；步骤二，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有苦瓜枯萎病菌；所述判断具体为：如果电泳结果在294bp位置出现单一的扩增条带，则说明样品中含有苦瓜枯萎病菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有苦瓜枯萎病菌。3.根据权利要求2所述的一种通过PCR试剂盒检测苦瓜枯萎病菌的方法，其特征在于，所述PCR试剂盒含有引物FOMM-SPF和引物FOMM-SPR。4.根据权利要求2所述的一种通过PCR试剂盒检测苦瓜枯萎病菌的方法，其特征在于，所述步骤一中所述的PCR试剂盒还含有PCR扩增缓冲液、阳性对照以及阴性对照。.5.根据权利要求2所述的一种通过PCR试剂盒检测苦...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁胜利，文才艺，李震，郭康迪，赵玉华，赵莹，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41