一种外切菊粉酶的生产方法技术

本发明专利技术提供了一种用本发明专利技术人采用基因重组方法，获得一株高效表达外切菊粉酶的巴斯德毕赤酵母重组Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　　ＥＸＴ　　２０８６菌株（ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ．０７６３）作为生产菌株，采用高密度发酵生产方法生产外切菊粉酶（发酵液中最高外切菊粉酶活性达到５７７．１４Ｕ／ｍｌ）。利用本发明专利技术可提高菊粉酶的产量并缩短产酶发酵高峰期，克服生产实践菊粉酶产量低、成本高的问题，适合工业化生产。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于制糖工业领域。蔗糖作为甜味剂的统治地位，因其营养弊端正受到其它更优越产品的挑战。长期大量食用蔗糖引起了一系列营养与健康问题——肥胖症、糖尿病、龋齿、高血压和心血管疾病等，随着经济发展这一问题越发突出。因此蔗糖替代品研发工作倍受重视。目前国际上，在众多的蔗糖替代品或者甜味剂品种中果糖产量一直上升紧追蔗糖，位居第二。这是因为果糖独具优势。其低热值性成为甜味剂和低热值食品原料新宠。目前国内外果糖生产途径之一是以淀粉为原料经过三种酶催化的多步化学反应生产果糖即多步法途径。以菊粉为原料依靠菊粉酶一步催化反应生产高纯度果糖即一步酶法生产途径的产业化，处于起步阶段。多采用多步法工艺生产高果糖浆(HFS)，即以玉米或水稻淀粉为原料，经过3种酶(淀粉酶，糖化酶和葡萄糖异构酶)催化反应和4～5个反应步骤，反应初产物为含果糖42％的果葡糖浆(第1代产品，F-42)，原料利用率和产物得率均很低。通过膜分离和循环反应可以制备含果糖55％(第2代产品，F-55)和90％(第3代产品，F-90)的高果葡糖浆，但成本增加高。一步法工艺具有与多步法工艺不同的特点或者优势一步法工艺只有一步菊粉酶催化反应，生产工序大为简化，生产成本降低，糖化初产物为高纯度(＞90％)果糖HFS，产物得率＞100％；多步法工艺需要3种不同酶催化反应和多步产物分离反应，初产物果糖得率＜50％。显然，菊粉酶是一步酶法生产菊粉高果糖浆的唯一重要酶种。一般采用液态发酵生产菊粉酶。据报道一种产菊粉酶的黑曲霉在摇床水平下，在30℃140r/min，至120h酶活达到27U/ml，168h酶活达到高峰为48.4U/ml，生物量达到28.8g/L(OhtaK.，Akimoto H.，Matsuda.，et al.，Molecular cloning and sequence analysis of two endo-inulinasegenes from Aspergillus niger.Biosci.Biotechnol.Biochem.，1998，621731-1738.)。最近报道(Ongen-Baysal G.and Sukan S.S.Production of inulinase mixed culture of Aspergillius nigerand Kluyveromyces marxianus.Biotechnol.Lett.1996，181431-1434.)一种产菊粉酶的黑曲霉在摇瓶水平下，28℃ 200r/min，菊粉酶至168h达到50U/ml的高峰值。一株K.marxianus最适生长与产酶温度为40～45℃，在1L发酵罐中采用无机培养基进行连续培养，培养基碳源限制为0.25％蔗糖，发酵参数为pO2控制在50％～70％，由1M KOH和0.5M H2SO4控制pH4.5，在0.1/h稀释速率下，最高胞外酶活32U/ml，I/S＝1/15，胞外酶与胞内酶比例依培养时间大致为50％～65％/50％～35％，培养基中残余蔗糖浓度与酶产量呈负相关(Rouwenhorst R.J.，Hensing M.，Verbakel J.，et al.Structure and properties of the extracellular inulinase of Kluyveromycesmarxianus CBS6556，Appl.Environ.Microbiol.，1988，541311-1137；1990，563337-3345.)。另一株K.marxianus NCYC 587在28℃ 200r/min，120h菊粉酶活性达34.5U/ml(Ongen-BaysalG.and Sukan S.S.Production of inulinase mixed culture of Aspergillius niger andKluyveromyces marxianus.Biotechnology Lett.1996，181431-1434.)。又一株Kluyveromyces菌株在由牛肉膏、玉米浆、尿素和菊芋汁组成的有机培养基上经摇瓶产酶正交试验结果最高菊粉酶胞外酶活性为15U/ml，在15L和1000L发酵罐上试验所得最高胞外酶产量分别为17.63和18.7U/ml(魏文铃等，克鲁维酵母Y-85合成菊粉酶最适条件的研究.微生物学报，1998，38208-212)。最新报道Bacillus sphaericus产菊粉酶的最佳碳源为0.75％菊粉，产菊粉酶178.4U/ml；最佳氮源为牛肉膏，产菊粉酶196.1U/ml(Kwon S.J，Yoo，J.Y.，Lee J.S.Isolation ofintracellular inulinase-producing bacterirum and culture condition for inulinase production.FoodSci.Biotechnol.，1999，824-29)。王建华等采用酵母高密度细胞发酵方法，当选天然菌株Kluyveromyces(CGMCC 0360)在120h(35～40℃，500～800r/min)最高菊粉酶产量达289U/ml，为20世纪90年代国际最高产量酶水平(王建华等。一种产生菊粉酶的酵母菌株及其在高果糖浆中的应用，1998，中国专利，专利申请号No.98120697.2；王建华等。菊粉酶高产酵母高密度培养及酶学性质研究。生物工程学报，2000；16(1)60-64)。菊粉酶(Inulinase)是能够水解β-2，1-D-果聚糖果糖苷键的一类水解酶，学名β-2，1-D-果聚糖酶，又叫β-果糖苷酶，或β-果聚糖水解酶，或2，1-D-果聚糖果聚糖水解酶，酶学编号为EC 3.2.1。根据菊粉酶酶切果聚糖链的方式分为内切酶(EC 3.2.1.7)和外切酶(EC3.2.1.80)；20世纪30年代初从微生物细胞中提取出菊粉酶，深入研究菊粉酶始于20世纪80年代中期，这是因为外切菊粉酶水解菊粉可得高纯度果糖，内切菊粉酶水解菊粉可得高纯度低聚果糖。果糖和低聚果糖是比蔗糖更为优秀的甜味剂、功能性食品原料和添加剂。本专利技术的目的是为选择一株菊粉酶的高产菌株并将该菌株用于菊粉酶的工业化生产的方法，以提高菊粉酶产量和缩短产酶发酵高峰期，解决生产实践中菊粉酶产量低、成本高的问题。本专利技术人采用基因重组方法，获得一株高效表达外切菊粉酶的重组酵母菌株，命名为巴斯德毕赤酵母重组Pichia pastoris EXI2086菌株，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国北京中关村北一条13号，100080)进行保藏，保藏号为CGMCCNo.0763，保藏日期为2002年7月10日。本专利技术的另一个目的是提供一种由本专利技术所获得的重组酵母菌株高密度发酵生产外切菊粉酶的方法。将以上方法生产出的发酵产物利用本专利技术人1999年1月29日提交的98120697.2专利申请的方法生产的菊粉酶降解菊粉生产高果糖浆的方法。本专利技术的技术路线见附图1。本专利技术的具体描述如下首先筛选出一株外切菊粉酶产生菌株，即外切菊粉酶基因供体菌株为克鲁维酵母菌Kluyveromy本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株外切菊粉酶产生菌株，其特征为该菌株是本专利技术人采用分子生物学的方法，获得的一株工程菌株，命名为：Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　ＥＸＩ２０８６，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为：ＣＧＭＣＣＮｏ．０７６３ ，保藏日期为：２００２年７月１０日。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王建华，王明华，滕达，张帆，姚怡，刘艳艳，王亚茹，
申请(专利权)人：王建华，中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]