一种用于Purα基因沉寂的慢病毒载体制造技术

本发明专利技术主要属于RNA沉寂技术领域，具体涉及一种用于Purα基因沉寂的慢病毒载体。所述慢病毒载体包括用于Purα基因沉寂的PurαRNAi寡核苷酸序列；所述PurαRNAi寡核苷酸序列所对应的Purα基因的基因靶位为666‑688，Purα基因中基因靶位为666‑688的基因序列为：CTCCTTGACTGTGGACAACAAGC(SEQ ID NO:1)。本发明专利技术所述PurαRNAi沉寂载体，便于转染效率高、用量少；能够高效稳定地抑制Purα基因的表达。

A lentivirus carrier for Pur - alpha gene silence

【技术实现步骤摘要】
一种用于Purα基因沉寂的慢病毒载体
本专利技术主要属于RNA沉寂
，具体涉及一种用于Purα基因沉寂的慢病毒载体。
技术介绍
在基因分析过程中对目的基因的敲除是一种行之有效的方法，但是在实际的操作过程中，对目的基因的敲除存在着周期长，费用高的问题，而且有些目的基因的系统性敲除会造成子代动物死亡于胚胎期或在出生后即死亡，并不能达到基因分析的目的。RNA干扰技术的出现为解决这一难题提供了一条有效的途径，基于RNA干扰技术的基因沉寂方法使得人们能够有效地对目的基因的功能进行研究，与基因敲除相比，基于RNA干扰技术的基因沉寂技术(以下称为RNA沉寂技术)的周期短，费用小，并且能大范围地应用于哺乳动物的原代培养的细胞之中。RNA沉寂技术是基于它的双链RNA(dsRNA)的形成，其反义链与目的基因的转录物形成互补结构。首先Dicer酶将长的dsRNA裂解成短的长度为21-23个碱基干扰RNA(siRNA)分子，其次多组分的诱导的RNA沉寂复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)利用siRNA来指导目的基因的转录物的序列特异性裂解。通过这种机制的基因沉寂可使用化学的方法将合成的siRNA转染到宿主细胞中，绕过剪切(dicing)步骤而对基因的表达进行沉寂(knock-down)。但是上述通过转染的方法在应用上存在着一定的限制，转染的效率的高低决定了目的基因沉寂的程度，尤其是对于某些原代培养的细胞来说，譬如原代培养的神经元细胞，其化学转染的效率太低以至于无法在实际中应用。所以高效的传递系统是实验是否成功的关键。最近出现的基于能编码发卡RNA，含有茎-环(stem-loop)结构，可以在细胞内产生siRNA样作用的载体，以实现对目的基因的沉寂作用。Dicer酶可以裂解发卡状RNA产生小片段的dsRNA，这种小的dsRNA可以沉寂目的基因序列中与其发卡结构中互补的转录物。但是绝大多数基于载体表达发卡结构的系统只是对目的基因的表达进行瞬时的干扰，所以在实际的应用中仍然有一定的限制和不足。但是，利用反转录病毒构建的表达发卡RNA的载体对培养的细胞进行感染可以建立长期稳定RNA沉寂的细胞系。尽管目前市场上有许多可用于进行RNA干扰(RNAInterferenceRNAi)的系统，譬如Invitrogen公司的Block-ItLentiviralRNAiExpressionSystem，但这些系统存在操作繁琐、周期也长、价格不菲的缺点，上述缺点对其广泛应用带来了一定的困难。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种用于Purα基因沉寂的慢病毒载体，该慢病毒载体转染效率高、用量少；能够高效稳定地抑制Purα基因的表达。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种用于Purα基因沉寂的慢病毒载体，所述慢病毒载体包括用于Purα基因沉寂的PurαRNAi寡核苷酸序列；所述PurαRNAi寡核苷酸序列所对应的Purα基因的基因靶位为666-688，Purα基因中基因靶位为666-688的基因序列为：CTCCTTGACTGTGGACAACAAGC(SEQIDNO:1)。进一步地，所述用于Purα基因沉寂的PurαRNAi寡核苷酸序列包括正义链序列和反义链序列，所述正义链序列为：5'-CCGGCTCCTTGACTGTGGACAACAAGCCTCGAGGCTTGTTGTCCACAGTCAAGGAGTTTT-3’(SEQIDNO:2)，所述反义链序列为：5'-AATTAAAACTCCTTGACTGTGGACAACAAGCCTCGAGGCTTGTTGTCCACAGTCAAGGAG-3’(SEQIDNO:3)。进一步地，所述用于Purα基因沉寂的PurαRNAi寡核苷酸序列的构建方法为：设计合成包括正义链和反义链的PurαRNAi寡核苷酸序列，所述正义链基因序列如SEQIDNO:2所示，所述反义链基因序列如SEQIDNO:3所示。进一步地，所述用于Purα基因沉寂的PurαRNAi寡核苷酸序列为双链寡核苷酸，其5’端含有CCGG和3’端含有AATT，并且其含有回文结构CTCGAG，其回文结构两端的序列完全互补，能够表达发卡状双链小RNA片段。本专利技术的有益技术效果：本专利技术所述PurαRNAi慢病毒载体转染效率高、用量少；能够高效稳定地抑制Purα基因的表达。附图说明图1为本专利技术所述pLKO.1puro慢病毒载体示意图；图2为PurαRNAi慢病毒载体转染293FT细胞后，Purα的表达结果图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。相反，本专利技术涵盖任何由权利要求定义的在本专利技术的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本专利技术有更好的了解，在下文对本专利技术的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本专利技术。实施例1一种用于Purα基因沉寂的慢病毒载体，所述慢病毒载体包括用于Purα基因沉寂的PurαRNAi寡核苷酸序列；所述PurαRNAi寡核苷酸序列所对应的Purα基因的基因靶位为666-688，Purα基因中基因靶位为666-688的基因序列为：CTCCTTGACTGTGGACAACAAGC(SEQIDNO:1)。所述用于Purα基因沉寂的PurαRNAi寡核苷酸序列包括正义链序列和反义链序列，所述正义链序列为：5'-CCGGCTCCTTGACTGTGGACAACAAGCCTCGAGGCTTGTTGTCCACAGTCAAGGAGTTTT-3’(SEQIDNO:2)，所述反义链序列为：5'-AATTAAAACTCCTTGACTGTGGACAACAAGCCTCGAGGCTTGTTGTCCACAGTCAAGGAG-3’(SEQIDNO:3)。所述用于Purα基因沉寂的PurαRNAi寡核苷酸序列的构建方法为：设计合成包括正义链和反义链的PurαRNAi寡核苷酸序列，所述正义链基因序列如SEQIDNO:2所示，所述反义链基因序列如SEQIDNO:3所示。所述用于Purα基因沉寂的PurαRNAi寡核苷酸序列为双链寡核苷酸，其5’端含有CCGG和3’端含有AATT，并且其含有回文结构CTCGAG，其回文结构两端的序列完全互补，能够表达发卡状双链小RNA片段。所述慢病毒载体还包括慢病毒载体pLKO.1-puro的基本序列、AgeI酶切位点和EcoRI酶切位点。一种用于Purα基因沉寂的慢病毒载体的制备方法，所述方法用于制备上述用于Purα基因沉寂的慢病毒载体，具体包括以下步骤：(1)合成用于Purα基因沉寂的PurαRNAi寡核苷酸序列：首先选取用于Purα基因沉寂的PurαRNAi寡核苷酸序列，该序列对应的Purα基因靶位为666-688(SEQIDNO:1)。设计合成的PurαRNAi寡核苷酸序列包括正义链和反义链，所述正义链基因序列如SEQIDNO:2所示，所述反义链基因序列如SEQIDNO:3所示，合成的PurαRNAi寡核苷酸序列的5’端含有CCGG，3’端含有AATT；合成的PurαRNAi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于Purα基因沉寂的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体包括用于Purα基因沉寂的PurαRNAi寡核苷酸序列；所述PurαRNAi寡核苷酸序列所对应的Purα基因的基因靶位为666‑688，Purα基因中基因靶位为666‑688的基因序列为：CTCCTTGACTGTGGACAACAAGC(SEQ ID NO:1)。

【技术特征摘要】
1.一种用于Purα基因沉寂的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体包括用于Purα基因沉寂的PurαRNAi寡核苷酸序列；所述PurαRNAi寡核苷酸序列所对应的Purα基因的基因靶位为666-688，Purα基因中基因靶位为666-688的基因序列为：CTCCTTGACTGTGGACAACAAGC(SEQIDNO:1)。2.根据权利要求1所述一种用于Purα基因沉寂的慢病毒载体，其特征在于，所述用于Purα基因沉寂的PurαRNAi寡核苷酸序列包括正义链序列和反义链序列，所述正义链序列为：5'-CCGGCTCCTTGACTGTGGACAACAAGCCTCGAGGCTTGTTGTCCACAGTCAAGGAGTTTT-3’(SEQIDNO:2)，所述反义链序列为：5'-AATTAAAAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁程敏，崔建奇，贾中发，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：宁夏,64