一种H7亚型禽流感病毒单克隆抗体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种H7亚型禽流感病毒单克隆抗体及应用，所述的单克隆抗体由杂交瘤细胞6B3分泌得到，该杂交瘤细胞已送至CCTCC保藏，保藏编号为：CCTCC NO：C2017204。所述的单克隆抗体效价高，特异性好，并且具有竞争效果，基于该单克隆抗体制备了H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒及检测方法，该方法具有快速、稳定、特异性高、灵敏度高的特点，利用该试剂盒对样品进行测试，本方法与HI试验有99％以上的符合率，敏感性为98.7％，特异性为99.3％，相对HI试验，缩短了试验时间，操作步骤更简单，可快速检测样品中是否含有H7亚型禽流感抗体，适合应用于家禽养殖场是否含有H7亚型禽流感病毒抗体的大批量检测。

A monoclonal antibody to H7 subtype avian influenza virus and its application

The invention discloses a H7 subtype avian influenza virus monoclonal antibody and application of monoclonal antibody, the secretion of 6B3 by hybridoma cells, the hybridoma cell has been sent to the CCTCC collection, preservation number of CCTCC NO:C2017204. The titer of monoclonal antibodies of the high specificity, and has a competitive effect, the preparation of monoclonal antibodies against H7 subtype avian influenza virus ELISA antibody detection kit and detection method based on the characteristic of this method is fast, stable, high specificity and high sensitivity, the samples are tested by using the kit. With this method, the HI test is consistent with the rate of above 99%, the sensitivity was 98.7%, specificity was 99.3%, relative to the HI test, the test time is shorter, more simple, whether the sample contains the rapid detection of H7 subtype avian influenza antibody, the detection of large quantities of suitable for poultry farms containing antibody H7 avian influenza virus.

【技术实现步骤摘要】
一种H7亚型禽流感病毒单克隆抗体及应用
本专利技术是属于临床免疫学
，更具体地，涉及一种H7亚型禽流感病毒单克隆抗体及应用。
技术介绍
H7亚型禽流感疫情自2013年出现以来一直没有得到有效的控制。虽然H7N9禽流感病毒还没有进化出人传人的能力，但是禽传人的事例时有发生。2016-2017冬春交接之际我国出现了第五次H7亚型禽流感爆发高峰，这次疫情比以前更为严重，表现为发病时间早和发病率高，并且病毒出现了耐药性突变和毒力增加的现象。针对H7亚型禽流感疫情现状，2017年6月初农业部办公厅发布在两广地区先行开展H7N9免疫工作，为两广地区及全国高效开展禽流感防控工作提供了坚强的技术保障。H7亚型禽流感推广免疫之后，就面临免疫后抗体水平的监测。常规的检测禽流感抗体的方法是血凝抑制(HI)试验。HI试验对操作人员的专业素质要求较高，过程繁琐，对结果的判定也有较强的的主观性。因此，研制一种H7亚型禽流感抗体检测试剂盒对我们评价疫苗免疫效果以及及时监测鸡群抗体水平显得极为重要。目前，关于H7亚型禽流感病毒的单克隆抗体的应用相继有报道，主要是在胶体金试纸条、间接免疫荧光、免疫组化等方面的应用，而具有竞争效果的单克隆抗体还未见报道。因此，需要提供一种简便、快速、敏感性高和特异性好，对H7亚型禽流感病毒有竞争效果的单克隆抗体检测试剂盒，为大规模临场检测提供便利。
技术实现思路
针对上述现有技术中的问题，以便于更简便、快速地对大量样品进行H7亚型禽流感病毒抗体的检测，本专利技术提供了一株分离的杂交瘤细胞株及由该杂交瘤细胞株分泌得到的抗H7亚型禽流感病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体效价高，特异性好，对H7亚型禽流感病毒抗体有竞争效果。本专利技术的另一目的在于提供了所述杂交瘤细胞或单克隆抗体的应用，利用该杂交瘤细胞或单克隆抗体制备H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒具有特异性好，灵敏度高，快速准确的特点。本专利技术的另一目的在于提供一种基于上述试剂盒的检测方法，用于H7亚型禽流感疫苗免疫效果的评价及鸡群抗体水平的监测。本专利技术的上述目的是由以下技术方案予以实现的。一株分离的杂交瘤细胞，所述的杂交瘤细胞命名为杂交瘤细胞6B3，保藏编号为：CCTCCNO：C2017204，保藏于中国典型培养物保藏中心。本专利技术所述的杂交瘤细胞株6B3的获得是利用灭活的H7-AIV抗原免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术建立抗H7-AIV单克隆抗体杂交瘤细胞库获得，并利用获得的单克隆抗体了建立H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒，鉴定待测动物样本是否含有H7亚型禽流感病毒抗体。杂交瘤细胞6B3在RPMI-1640完全培养基中，在含5％CO2，37℃条件下培养48小时，显微镜下观察，细胞生长良好，呈葡萄串状、集落浑圆透亮，符合杂交瘤细胞的培养特性。对杂交瘤细胞6B3最高限制代次(F25代)的细胞进行传代稳定性检测，结果每代细胞均能稳定分泌特异性的单克隆抗体，抗体阳性率为100％，并且细胞培养上清的HI抗体效价均在27以上，说明该杂交瘤细胞具有稳定分泌抗体的能力。所述杂交瘤细胞株已于2017年10月17日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCCNO：C2017204，分类命名：杂交瘤细胞6B3，地址：中国武汉武汉大学。本专利技术还提供了所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体6B3。本专利技术还提供了所述的杂交瘤细胞或所述的单克隆抗体在制备H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒中的应用。本专利技术还提供了一种H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒包含：包被抗原的酶标板和酶标记的所述单克隆抗体，所述抗原包被板的包被抗原为H7亚型血凝抑制试验抗原；所述单克隆抗体为所述的单克隆抗体6B3。优选的，所述抗原的包被浓度为1:160。优选的，所述试剂盒还包含：阴性对照、阳性对照、样品稀释液、底物液A、底物液B、洗涤液和终止液。优选的，所述阴性对照为SPF鸡血清；所述阳性对照为H7亚型禽流感标准阳性血清；所述样品稀释液为0.01MPBS溶液中加入0.05％的Tween-20；所述底物液A为Na2HPO4·12H2O14.60g，柠檬酸9.33g，30％的双氧水2ml，加去离子水溶解并定容至1000ml，调pH至5.0～5.4后分装成10ml/瓶；所述底物液B为四甲基联苯胺(TMB)20.00mg、无水乙醇10.00ml，加去离子水溶解定容至1000ml，分装成10ml/瓶；所述洗涤液为0.01MPBS溶液中加入0.05％的Tween-20；所述终止液为0.25％的HF溶液。基于所述的试剂盒进行H7亚型禽流感病毒抗体检测的方法，按照竞争ELISA检测方法进行检测，包括如下步骤：S1.取出包被抗原的酶标板，用稀释好的洗涤液200μl/孔洗板1次后拍干；分别将稀释好的血清样品、阴性对照、阳性对照各取50μl与所述酶标抗体50μl同时加入到抗原包被板孔中，其中阴性对照、阳性对照各设2孔，待检样品设1孔，振荡混匀，置37℃下温育45分钟；S2.弃去孔中的液体，每孔加入稀释好的洗涤液300μl，弃去洗涤液，并在吸水纸上拍干，共计洗涤5次；S3.每孔先加底物液A50μl、再加底物液B50μl，混匀，室温避光显色，每孔加入终止液50μl终止显色，混匀后测定OD450nm值；S4.结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD450nm值应＞0.5，阳性对照孔平均OD450nm值应＜0.5；S＝样品孔OD450nm值，N＝阴性对照孔平均OD450nm值，计算样品样品竞争率(1-S/N)值；若竞争率＞0.4时判为阳性；若竞争率≤0.4时判为阴性。与现有技术相比，本专利技术有益效果在于：本专利技术得到的单克隆抗体6B3，是首次得到的对H7亚型禽流感病毒有竞争效果的单抗，用其制备的腹水纯化后对H7-AIV的血凝抑制HI效价为18log2，ELISA效价高达4×105，用于制备的H7亚型禽流感竞争ELISA抗体检测试剂盒，具有快速、稳定、特异性高、灵敏度高的特点，本方法与HI试验有99％以上的符合率，敏感性为98.7％，特异性为99.3％，且操作步骤更简单，可快速检测样品中是否含有H7亚型禽流感抗体，适合应用于家禽养殖场是否含有H7亚型禽流感病毒抗体的大批量检测。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。以下以具体实施条件为例对本专利技术方法进行进一步说明。实施例1：杂交瘤细胞株6B3单克隆抗体的建立1)动物免疫取购自哈维科的H7标准抗原一瓶用500μL生理盐水重悬，与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下分点注射8周龄BALB/c小鼠200μL/只；2周、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再各免疫一次；6周后取相同剂量抗原腹腔注射，不加佐剂；4天后融合。2)细胞融合骨髓瘤细胞的准备选择生长状态良好的SP2/0细胞，密度长至培养瓶底75％时弃上清，以不完全DMEM培养基洗涤一次后，用l0mL不完全DMEM培养基将细胞轻轻吹下。脾淋巴细胞的准备本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株分离的杂交瘤细胞，所述的杂交瘤细胞命名为杂交瘤细胞6B3，保藏编号为：CCTCC NO：C2017204，保藏于中国典型培养物保藏中心。

【技术特征摘要】
1.一株分离的杂交瘤细胞，所述的杂交瘤细胞命名为杂交瘤细胞6B3，保藏编号为：CCTCCNO：C2017204，保藏于中国典型培养物保藏中心。2.权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体6B3。3.权利要求1所述的杂交瘤细胞或权利要求2所述的单克隆抗体在制备H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒中的应用。4.一种H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：包被抗原的酶标板和酶标记的所述单克隆抗体，所述抗原包被板的包被抗原为H7亚型血凝抑制试验抗原；所述单克隆抗体为权利要求2所述的单克隆抗体6B3。5.根据权利要求4所述的一种H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含：阴性对照、阳性对照、样品稀释液、底物液A、底物液B、洗涤液和终止液。6.基于权利要求5所述的试剂盒进行H7亚型禽流感病毒抗体检测的方法，其特征在于，按照竞...

【专利技术属性】
技术研发人员：范俊青，但汉并，贾慧勤，周云朵，韦奇勇，李盼盼，董俊，王园园，董晓辉，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42