一种鸡血藤种子超低温保存方法技术

本发明专利技术提供了一种鸡血藤种子超低温保存方法，包括步骤以下：室温下将鸡血藤种子用水洗净，用营养液培育，培育20～50min后，取出培育过的鸡血藤种子；培育过的鸡血藤种子放入冻存管中，再加入抗冻液进行室温温育15～35min，再将其放入梯度降温盒中；将带有鸡血藤种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在‐35℃～‐60℃，降温速度为‐1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用；经低温保存6年后，再将降温盒从液氮中取，缓慢解冻，洗净后用于种子发芽。

A seed cryopreservation method of Caulis Spatholobi

【技术实现步骤摘要】
一种鸡血藤种子超低温保存方法
本专利技术涉及一种鸡血藤种子超低温保存方法，属于药材种子资源保存

技术介绍
鸡血藤又叫为五味子科、大血藤科、菟丝子科、被子植物门，双子叶植物纲，蝶形花科等多种植物的别称。常绿木质藤本，无毛，新枝暗绿色，基部宿存有数枚三角状芽鳞。生于海拔1800米以下的林中，分布于云南西南部、广西、缅甸东北部也有。茎暗紫绿色，有灰白色皮孔，主根黄褐色，横切面暗紫色。叶纸质，椭圆形或卵状椭圆形，长6～13厘米，宽3～6厘米，先端骤狭短急尖或渐尖，基部阔楔形或圆钝，全缘或有疏离的胼胝质小齿，侧脉每边7～10条，干后两面近同色，下面具密被极细的白腺点。花单性同株，雄花：花被片乳黄色，14～18片，具透明细腺点及缘毛，中轮最大1片，卵形或椭圆形，长10～17毫米，宽8～10毫米；花托椭圆体形，顶端伸长圆柱形，圆锥状凸出于雄蕊群外；雄蕊群椭圆体形或近球形，直径6～8毫米，具雄蕊约60枚；雄蕊长0.8～1.5毫米；花丝与药隔连成宽扁倒梯形，顶端横长椭圆形，药室长为雄蕊长的2/3，具明显花丝；花梗长7～15毫米。雌花：花被片与雄花的相似而较大；雌蕊群卵圆形或近球形，直径8～10毫米，具雌蕊60～70枚，花柱顶端具状的柱头冠，中部向下延长至基部，胚珠3～5枚，叠生于腹缝线上。聚合果近球形，直径5～10厘米，成熟心皮倒卵圆形，顶端厚革质，具4～5角。花期5～6月，果熟期9月。鸡血藤根味苦微甘、性温，归肝、心、肾经；色赤入血，质润行散；具有活血舒筋，养血调经的功效；主治风湿痹痛，手足麻木，肢体瘫痪，月经不调，经行不畅，痛经，经闭，白细胞减少症。由于鸡血藤具有重要的药用价值，近年来人们对其进行大肆采挖，使野生鸡血藤的分布量迅速减少，造成市场对该药需求量大增，对鸡血藤种子需求也随之增加。目前种质资源保存方式为常温、低温保存鸡血藤种子两种方式。常温保存中药材种子，需要每年重新繁种更新，因为植物种子经过常温保存，活力降低很快；低温保存植物种子，在中国，建立了国家中期库和国家种质库，国家中期库保存的温度为4℃左右，相对湿度小于65％，一般设计贮藏种子的寿命为5～10年，国家种质库为种质长期保存库，库中的温度为-18℃左右，相对湿度小于50％，设计贮藏寿命达20年以上，也就是说种质在长期库中保存，活力同样随着时间的推移降低，种质20年后一般需要更新繁种，不是永久的保存。因此，为了安全保存鸡血藤种质资源，研究探索一种安全而长久保存鸡血藤种质资源的方法很有意义，它能够减少或者避免种子更新繁种，省时省力，阻断繁种更新的过程中种质间基因漂移等产生种质变异，保证种质的遗传稳定性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种适合于鸡血藤种子的超低温保存法，该方法能够补充现在鸡血藤种质资源保存技术的不足，可以长期安全的保存鸡血藤种质资源，为鸡血藤种质资源保存提供一条新的有效的技术途径。本专利技术的目的是提供一种鸡血藤种子超低温保存方法，包括步骤以下：(1)室温下将鸡血藤种子用水洗净，用营养液培育，培育20～50min后，取出培育过的鸡血藤种子；(2)培育过的鸡血藤种子放入冻存管中，再加入抗冻液进行室温温育15～35min，再将其放入梯度降温盒中；(3)将带有鸡血藤种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在-35℃～-60℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用；(4)经低温保存6年后，再将降温盒从液氮中取，缓慢解冻，洗净后用于种子发芽。所述鸡血藤种子为当年收获鲜种，自然晒干，种子含水量为6～15％。在一个具体方案中，步骤(1)中所述营养液指MS液体培养液，还包含有1.5～2.5mol/L甘油和1～1.5mol/L二甲基亚砜。所述营养液优选105～121℃高压蒸汽灭菌15min以上，冷却至室温放置。在一个具体方案中，步骤(2)中所述梯度降温盒中含有100％甘油或异丙醇，可以重复使用。在一个具体方案中，步骤(2)中所述抗冻液是指MS液体培养液，还包含有2.6～3.5mol/L甘油、1.5～2.5mol/L二甲基亚砜和0.40～0.80mol/L蔗糖。所述抗冻液优选105～121℃高压蒸汽灭菌15min以上，冷却至室温放置。在一个具体方案中，步骤(3)中所述低温冰箱的温度要求一般在-70℃以下。鸡血藤上述所保存的鸡血藤种子进行解冻时，若室温超过20℃，将冻存管从液氮中取出，直接利用室温自然解冻；若室温低于20℃，将冻存管从液氮中取出，并置于20～24℃水浴箱中解冻。解冻完后，取出冻存管中鸡血藤种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤3～5次，清洗后鸡血藤种子直接用于培养。技术效果1、本专利技术进行鸡血藤超低温保存，工艺简单，稳定性可靠，保存后的鸡血藤种子的发芽率和鲜种的发芽率无显著性差异，发芽试验结果表明超低温保存后鸡血藤种子发芽率高达95％以上。2、本专利技术具有长期、有效、安全保存鸡血藤种子，是鸡血藤种质资源长期保存的最有效方法。具体实施方式下面，本专利技术将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任何一个或类似实例。实施例1取某地当年收获的鸡血藤，洗净后自然晒干，将含水量8.6％左右的鸡血藤种子用含有2.35mol/L甘油和1.25mol/L二甲基亚砜的MS液体培养液温育，温育20min后，取出温育过的鸡血藤种子，再放入冻存管中，再加入含有3.2mol/L甘油、1.65mol/L二甲基亚砜和0.6mol/L蔗糖的MS，室温温育30min，再将其放入梯度降温盒中；鸡血藤将梯度降温盒放进-70℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在-50℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存5年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中鸡血藤种子从液氧取出室温解冻，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后鸡血藤种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到97.34％。对照实施例1取某地当年收获的鸡血藤，洗净后自然晒干，将含水量8.6％左右的鸡血藤种子用含有2.35mol/L甘油的MS液体培养液温育，温育20min后，取出温育过的鸡血藤种子，再放入冻存管中，再加入含有3.2mol/L甘油、1.65mol/L二甲基亚砜和0.6mol/L蔗糖的MS，再将其放入梯度降温盒中；将梯度降温盒放进-70℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在-50℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存5年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中鸡血藤种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后鸡血藤种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到79.62％。对照实施例2取某地当年收获的鸡血藤，洗净后自然晒干，将含水量8.6％左右的鸡血藤种子用含有2.35mol/L甘油和1.25mol/L二甲基亚砜的MS液体培养液温育，温育20min后，取出温育过的鸡血藤种子，再放入冻存管中，再加入含有3.2mol/L甘油、1.65mol/L二甲基亚砜和0.6mol/L蔗糖的MS，室温温育30min，再将其放入在-5℃左右低温冰箱保存5年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡血藤种子超低温保存方法，包括步骤以下：(1)室温下将鸡血藤种子用水洗净，用营养液培育，培育20～50min后，取出培育过的鸡血藤种子；(2)培育过的鸡血藤种子放入冻存管中，再加入抗冻液进行室温温育15～35min，再将其放入梯度降温盒中；(3)将带有鸡血藤种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在‐35℃～‐60℃，降温速度为‐1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用；(4)经低温保存6年后，再将降温盒从液氮中取，缓慢解冻，洗净后用于种子发芽。

【技术特征摘要】
1.一种鸡血藤种子超低温保存方法，包括步骤以下：(1)室温下将鸡血藤种子用水洗净，用营养液培育，培育20～50min后，取出培育过的鸡血藤种子；(2)培育过的鸡血藤种子放入冻存管中，再加入抗冻液进行室温温育15～35min，再将其放入梯度降温盒中；(3)将带有鸡血藤种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在‐35℃～‐60℃，降温速度为‐1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用；(4)经低温保存6年后，再将降温盒从液氮中取，缓慢解冻，洗净后用于种子发芽。2.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中所述营养液指MS液体培养液，还包含有1.5～2.5mol/L甘...

【专利技术属性】
技术研发人员：向华，
申请(专利权)人：长沙湘资生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43