利用埃希杆菌属细菌生产L-氨基酸的方法技术

通过在培养基中培养埃希杆菌，并从培养基中收集产生并积累的Ｌ－氨基酸来生产Ｌ－氨基酸（例如Ｌ－苯丙氨酸或Ｌ－苏氨酸），其中通过增强ｙｅｄＡ基因编码的蛋白质活性而提高了这些细菌对Ｌ－氨基酸的生产效率。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术，具体涉及发酵生产L-氨基酸的方法，更具体地涉及来源于大肠杆菌的一个基因。该基因能提高L-氨基酸，例如L-苯丙氨酸和L-苏氨酸的生产效率。
技术介绍
传统上，利用天然来源微生物菌株或对该微生物菌株特别修饰以提高L-氨基酸生产效率的突变株进行发酵，来实现L-氨基酸的工业生产。现已公开了许多提高L-氨基酸生产效率的技术，例如用重组DNA转化微生物(参见美国专利4,278,765)。这些技术建立在提高参与氨基酸生物合成的酶活性和/或降低对生成的氨基酸起反馈抑制作用的靶标酶敏感性的基础之上(参见日本专利申请No 56-18596(1981)，WO 95/16042或美国专利5,661,012和6,040,160)。另一方面，增高氨基酸的分泌活性也可以提高L-氨基酸产生株的生产效率。已经公开了一种属于棒状杆菌属的赖氨酸产生株，其赖氨酸分泌基因(lysE基因)的表达增加(WO 9723597A2)。此外，还公开了用于L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸或噻唑烷衍生物分泌的外泌蛋白的编码基因(美国专利5,972,663)。目前，已公开了大肠杆菌中几个能增加L-氨基酸产量、编码产物推定为膜蛋白质的基因。rhtB基因的额外拷贝使细菌对L-高丝氨酸的耐受增加并提高L-高丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的产量(欧洲专利申请EP994190A2)。rhtC基因的额外拷贝使细菌对L-高丝氨酸、L-苏氨酸更具耐受力，并提高L-高丝氨酸、L-苏氨酸和L-亮氨酸的产量(欧洲专利申请EP1013765A1)。yahN、yeaS、yfiK和yggA基因的额外拷贝能提高L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的产量(欧洲专利申请EP1016710A2)。在本专利技术人早期曾获得了一个大肠杆菌K-12突变株，该突变株具有突变的thrR基因(在这里被称作rhtA23)，该突变与该菌株对基础培养基中高浓度的苏氨酸和高丝氨酸的耐受性有关(Astaurova，O.B.etal.，Appl.Biochem.Microbiol.，21，611-616，1985)。对于不同的大肠杆菌生产株系，突变分别提高了L-苏氨酸(SU974817)、高丝氨酸和谷氨酸盐(Astaurova，O.B.et al.，Appl.Biochem.Microbiol.，27，556-561，1991)的产量。另外，本专利技术人发现rhtA基因位于大肠杆菌染色体的第18微小体(min)处，邻近编码谷氨酰胺转运体系组分的glnHPQ操纵子，而且与pexB基因和ompX基因之间的ybiF开放式阅读框一致。表达这个开放式阅读框编码的蛋白质的DNA单位定名为rhtA基因(rht高丝氨酸和苏氨酸耐受)。此外，本专利技术人发现rhtA基因扩增也会增加细菌对高丝氨酸、苏氨酸的耐受性。rhtA23突变将在其ATG起始密码子-1位上的A替换为G(1997年8月24-29号在加利福尼亚旧金山市召开的第17届国际生物化学和分子生物学大会及1997年美国生物化学和分子生物学界年会论文摘要第457号)。已知起始密码子和SD序列的间隔区核苷酸组成、尤其是起始密码子即上游的序列极大地影响mRNA的翻译能力。现已发现起始密码子前三位的核苷酸的差异可造成基因表达水平相差20倍(Gold et al.，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-403 1981；Hui et al.，EMBO J.，3，623-629，1984)。因此，rhtA23突变可增加rhtA的基因表达。rhtA基因编码一个由295个氨基酸残基组成，高度疏水，含10个预测跨膜区段的蛋白质。对大肠杆菌K-12株系核苷酸序列进行PSI-BLAST检索(Science，277，1453-1474(1997))显示至少有10个RhtA蛋白的类似物。其中包括由ydeD和yedA基因编码的蛋白质。较早些时候，人们发现ydeD基因参与半胱氨酸通路代谢产物的外泌(Dassler et al.，Mol.Microbiol.，36，1101-1112，2000；US5,972,663)。yedA基因可编码推断为跨膜亚单位的蛋白质，蛋白质(GenBank编码AE000287 U00096序列中8037～8957位氨基酸)的功能还不清楚。
技术实现思路
本专利技术的目的是提高L-氨基酸生产菌株的生产效率，并提供利用这样的菌株生产L-氨基酸的方法，例如生产L-苯丙氨酸和L-苏氨酸。本专利技术的目标是通过对yedA基因的鉴定而实现的。yedA基因编码一种膜蛋白，它是RhtA的类似物，并不参与目标L-氨基酸的生物合成路径，而当细菌多拷贝载体上的该基因的野生型等位基因扩增时可增高微生物对几种氨基酸和氨基酸类似物的耐受。此外，yedA基因附加拷贝导入各种氨基酸产生株时，yedA基因可提高氨基酸的产量。本专利技术由此得以完成。本
技术实现思路
如下1)埃希杆菌(Escherichia)属的L-氨基酸生产菌，其中通过增强细菌细胞内下面(A)或(B)所定义的蛋白质的活性提高细菌的L-氨基酸的产量(A)含有序列表SEQ ID NO2中氨基酸序列的蛋白质。(B)含有对序列表SEQ ID NO2中氨基酸序列缺失、替换、插入或添加一个或几个氨基酸后所得的序列，且具有使细菌增强对例如苯丙氨酸、苏氨酸、高丝氨酸或半胱氨酸的L-氨基酸和/或例如对-氟-苯丙氨酸、5-氟-DL-色氨酸、S-(2-氨乙基)半胱氨酸或4-氮杂-DL-亮氨酸的氨基酸类似物的耐受性的活性。(在下文中，上述(A)或(B)定义的蛋白质称为“本专利技术的蛋白质”)；2)如上所述细菌，其中使用编码(A)或(B)所定义蛋白质的DNA转化该细菌，或者通过改变细菌染色体中上述DNA的表达调控序列，来增强(A)或(B)所定义蛋白质的活性。3)如上所述细菌，其中转化使用含有所述DNA的多拷贝载体进行的。4)生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养如前所述的细菌，并从培养基中收集所产生并积累的L-氨基酸。5)如上所述的方法，该方法所产生的L-氨基酸为L-苯丙氨酸。6)如上所述的方法，其中细菌提高了苯丙氨酸生物合成基因的表达。7)如上所述的方法，其中产生的L-氨基酸为L-苏氨酸。8)如上所述的方法，其中细菌提高了苏氨酸操纵子的表达。9)如上所述的方法，其中细菌提高了参与色氨酸生物合成的基因的表达。10)生产α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯的方法，该方法包括在培养基中培养上述细菌，以在培养基中生成并积累L-苯丙氨酸，所述细菌具有L-苯丙氨酸生产能力；从天冬氨酸或其衍生物和获得的L-苯丙氨酸来合成α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯。11)如前所述的方法，进一步包括酯化L-苯丙氨酸以生产L-苯丙氨酸低级烷基酯，用天冬氨酸衍生物凝聚(condensing)L-苯丙氨酸低级烷基酯，其中衍生物是N-酰基-L-天冬氨酸酐，从反应混合物中分离N-酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯，氢化N-酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯，产生α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯。本专利技术中除非另外注明，氨基酸均为L-本文档来自技高网...

【技术保护点】
埃希杆菌属的Ｌ－氨基酸生产细菌，其中通过增强细菌细胞内下面（Ａ）或（Ｂ）所定义的蛋白质活性提高细菌的Ｌ－氨基酸的产量（Ａ）含有序列表ＳＥＱＩＤＮＯ：２中氨基酸序列的蛋白质；（Ｂ）含有对序列表ＳＥＱＩＤＮＯ：２ 中氨基酸序列缺失、替换、插入或添加一个或几个氨基酸后所得的序列，且具有使细菌增强对Ｌ－氨基酸和／或氨基酸类似物的耐受性的活性的蛋白质。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：VA里斯特斯，MV维图斯基纳，MM古斯亚蒂纳，MK兹亚特蒂诺夫，VZ阿维蒂安，EA萨拉索瓦，VG多罗森科，SV马斯科，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]